Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultivierung und Identifizierung von Kohlenwasserstoff abbauenden Mikroorganismen aus ökologischen Lebensräumen. Diese Methode erfordert keine ausgeklügelten Instrumente und kann problemlos in einem Standard-Laboraufbau durchgeführt werden. Es kann auch leicht angepasst werden, um andere Substrate zu untersuchen.
Diese Technik lässt sich leicht auf verschiedene ökologische Nischen übertragen, und der Abbau verschiedener Substrate kann bewertet werden. Das Verfahren wird von Deepa Sethi, einer Doktorandin aus dem Labor von Dr. Richa Priyadarshini, demonstriert. Sammeln Sie zunächst 500 Milliliter Wasserprobe in fünf sterilen Glasflaschen von verschiedenen Gewässerstandorten und messen Sie den pH-Wert und die Temperatur jeder Probe.
Anschließend wird die Probe unter aseptischen Bedingungen in Chargen von 100 Millilitern durch Filterschichten mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern filtriert. Und legen Sie die Blätter auf verschiedene Nährmedienplatten, wobei Sie ein Papier pro Teller platzieren. Ziehen Sie das Papier nach zwei Stunden mit einer sterilen Pinzette ab.
Als nächstes verdünnen Sie die ungefilterten Wasserproben, indem Sie 100 Mikroliter der gesammelten Wasserprobe zu 900 Mikrolitern sterilem, doppelt destilliertem Wasser hinzufügen. Fahren Sie mit den zehnfachen Verdünnungen fort, bis ein Verdünnungsverhältnis von eins zu 1.000.000 erreicht ist. Mischen Sie durch Pipettieren und stellen Sie sicher, dass das Endvolumen jeder Verdünnung einen Milliliter beträgt.
Verteilen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Wasserproben einzeln auf alle Nährmediumplatten, in dreifacher Ausführung. Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden, je nach Wachstum der Kolonien. Um isolierte Kolonien zu erhalten, wählen Sie eine Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Pipettenspitze aus.
Führen Sie Quadrantenstreifen durch und inkubieren Sie die Platte über Nacht. Am nächsten Tag screenen Sie die Kolonien anhand ihrer morphologischen Merkmale wie Farbe, Textur, Form, Größe, Rand und Höhe. Bestreifen Sie die Kolonien erneut, um Reinkulturen zu erhalten.
Nach der Grammfärbung jeder Reinkultur bereiten Sie die Glycerinvorräte vor, indem Sie eine einzelne Kolonie in drei Milliliter geeigneter Wachstumsmedien impfen und bei 30 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag werden 700 Mikroliter der Nachtkultur und 300 Mikroliter 100%iges Glycerin in Kryo-Fläschchen gegeben. Frieren Sie die Fläschchen bei minus 80 Grad Celsius ein, um sie langfristig zu lagern.
Wählen Sie aus einem frisch gestreiften Teller eine Kolonie aus und impfen Sie sie mit fünf Millilitern Triptyc-Sojabrühe oder Nährbrühe. Züchten Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 Umdrehungen pro Minute, bis die Absorption etwa zwei erreicht. Am nächsten Tag pelletieren Sie die Zellen.
Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal mit zwei Millilitern autoklavierter Kochsalzlösung. Drehen Sie die Zellen erneut, suspendieren Sie das Pellet dann erneut in zwei Milliliter flüssigem kohlenstofffreiem Basalmedium (LCFBM) und messen Sie die Absorption. Als nächstes werden zwei sterile 150-Milliliter-Erlenmeyerkolben für die Kontroll- bzw. Versuchsgruppe als A und B gekennzeichnet.
In Kolben A werden 40 Milliliter LCFBM zugegeben, gefolgt von einem Styrol mit einer Endkonzentration von fünf Millimolaren. In Kolben B werden 35 Milliliter LCFBM und Styrol zugegeben. Anschließend wird die Zellsuspension mit einer Endabsorption von ca. 0,1 zugegeben.
Nachdem das Volumen in Kolben B mit LCFBM auf 40 Milliliter erhöht wurde, werden beide Kolben 30 Tage lang bei 30 Grad Celsius unter Schütteln bei 200 U/min inkubiert. Messen Sie die Absorption jedes Kolbens alle fünf Tage und zeichnen Sie eine Wachstumskurve auf. Verlängern Sie die Inkubationszeit um bis zu 45 Tage, wenn die Bakterien Styrol verwerten können.
Eine Erhöhung der Absorption deutet darauf hin, dass das Bakterium Styrol verstoffwechseln kann. Um genomische DNA aus gramnegativen Bakterien zu isolieren, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und impfen Sie sie in einem frischen Wachstumsmedium in einem sterilen Reagenzglas. Nach der nächtlichen Inkubation in einem Schüttelinkubator werden 1,5 Milliliter der gewachsenen Kultur pelletiert.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikroliter Lysepuffer. Dann 66 Mikroliter fünfmolare Natriumchloridlösung hinzufügen und gut mischen. Nach dem Zentrifugieren der resultierenden Mischung wird das klare Supinat in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert und ein gleiches Volumen Chloroform hinzugefügt.
Mischen Sie die Lösung, indem Sie sie mehrmals invertieren, bis eine milchige Lösung beobachtet wird. Drehen Sie das Röhrchen erneut und geben Sie den Überstand in ein sauberes Fläschchen. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter eiskaltes 100%iges Ethanol hinzu und mischen durch Inversion, bis weiße DNA-Stränge ausfallen.
Zentrifugieren Sie die gefällte DNA. Verwerfen Sie den Überstand. Und waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter 70%igem Ethanol.
Lassen Sie das DNA-Pellet nach dem Entsorgen der Wäsche fünf Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen. Nach dem Trocknen wird das Pellet wieder in 100 Mikroliter Tris-EDTA-Puffer eingelegt. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und lassen Sie die DNA auf einem 1%igen Agarose-Gel laufen, um ihre Qualität zu beurteilen.
Um die Stämme zu identifizieren, wird die aus den reinen Bakterienkulturen isolierte DNA mittels PCR amplifiziert, wobei universelle Primer auf die ribosomale 16S-RNA-Sequenz für Bakterien abzielen. Bereiten Sie 25 Mikroliter der PCR-Mischung auf Eis vor, fügen Sie einen Mikroliter der DNA-Vorlage hinzu und legen Sie die Zyklusbedingungen für die Genamplifikation fest. Mischen Sie nach der PCR fünf Mikroliter der Probe mit einem Mikroliter fünffachen DNA-Beladungsfarbstoff.
Und lassen Sie es auf einem 1%igen Agarose-Gel laufen, um die Amplifikation zu überprüfen. Für die ribosomale rNA-Gensequenzierung wird die gleiche Reaktion wie zuvor beschrieben, jedoch in einem höheren Volumen. Um dann die Amplikons für die Sanger-Sequenzierung zu reinigen, mischen Sie die gesamte Probe mit DNA-Ladefarbstoff und laden Sie sie auf ein Agarose-Gel, um die Gelextraktionsmethode durchzuführen.
Sobald die Sequenzierung abgeschlossen ist, konvertieren Sie die Ergebnisdatei in ein schnelleres Format und überprüfen Sie die Sequenzähnlichkeit mit dem BLAST-Tool auf NCBI. Hier sind Bakterienkolonien zu sehen, die aus Wasserproben aus einem Feuchtgebiet in Dadri, Indien, isoliert wurden. Die isolierten Bakterien wurden einzeln in den jeweiligen Medien gezüchtet, wobei flüssiges Styrol als einzige Kohlenstoffquelle diente.
Das Kohlenwasserstoffabbaupotenzial der Bakterienisolate wurde mit Hilfe eines Catechol-Abbau-Assays untersucht. Ein repräsentativer Assay für eines der Isolate ist hier dargestellt. Die Integrität der genomischen DNA wurde durch die Visualisierung einer kleinen DNA-Probe auf einem Agarose-Gel bestätigt.
Und das ribosomale rNA-Gen 16S wurde mit Hilfe von universellen Primern amplifiziert. Ein phylogenetischer Stammbaum wurde erstellt, um die Verwandtschaft zwischen Exiguobacterium-Stämmen, die aus einem Feuchtgebiet isoliert wurden, mit den bekannten Exiguobacterium-Arten darzustellen. Ein kritischer Schritt des Protokolls besteht darin, die Auslastung des zu testenden Substrats zu überprüfen.
Abhängig von den Wachstumsmerkmalen kann es sein, dass sich die Mikrobe nicht sofort an die Verwendung des zu testenden Substrats anpasst und einen Anreicherungsprozess benötigt. Diese Methode konzentriert sich auf die kultivierbare Bakterienpopulation in Umweltproben. Darüber hinaus können die Forscher Experimente durchführen, wie z. B. die Sequenzierung des gesamten Genoms von Bakterien und die Erstellung von Stoffwechselprofilen, die wertvolle Einblicke in Gene und Signalwege liefern können, die am Abbau von Kohlenwasserstoffen beteiligt sind.
