이 프로토콜은 생태 서식지에서 탄화수소 분해 미생물의 분리, 재배 및 식별에 대해 설명합니다. 이 방법은 정교한 기기가 필요하지 않으며 표준 실험실 설정에서 쉽게 수행할 수 있습니다. 또한 다른 기질을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.
이 기술은 다양한 생태 학적 틈새로 쉽게 번역 될 수 있으며 다양한 기질의 분해를 평가할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 Dr.Richa Priyadarshini 실험실의 박사 과정 학생 인 Deepa Sethi가 될 것입니다. 시작하려면 서로 다른 수역 현장에서 5개의 멸균 유리병에 500ml의 물 샘플을 수집하고 각 샘플의 pH와 온도를 측정합니다.
그런 다음 무균 조건에서 0.22 미크론 공극 크기 필터 시트를 통해 100 밀리리터의 배치로 샘플을 여과합니다. 그리고 시트를 다른 영양 배지 접시 위에 놓고 접시 당 하나의 종이를 놓습니다. 2 시간 후 멸균 집게를 사용하여 종이를 떼어냅니다.
다음으로, 수집 된 물 샘플 100 마이크로 리터를 멸균 이중 증류수 900 마이크로 리터에 첨가하여 여과되지 않은 물 샘플을 희석한다. 1 대 1, 000, 000의 희석 비율에 도달 할 때까지 10 배 희석을 계속하십시오. 피펫팅으로 혼합하고 각 희석액의 최종 부피가 1밀리리터인지 확인합니다.
희석된 물 샘플 100마이크로리터를 모든 성장 배지 플레이트에 개별적으로 세 번 뿌립니다. 콜로니의 성장에 따라 섭씨 30도에서 24 시간에서 48 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 격리된 콜로니를 얻으려면 멸균 이쑤시개나 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 선택하십시오.
사분면 줄무늬를 수행하고 플레이트를 밤새 배양합니다. 다음날, 색상, 질감, 모양, 크기, 여백 및 높이와 같은 형태학적 특징을 기반으로 식민지를 선별합니다. 순수한 문화를 얻기 위해 식민지를 다시 줄무늬를 만드십시오.
각각의 순수 배양액의 그람 염색을 수행한 후, 3밀리리터의 적절한 성장 배지에 단일 콜로니를 접종하고, 섭씨 30도에서 배양하여 글리세롤 스톡을 제조한다. 다음날, 700 마이크로리터의 하룻밤 배양액과 300 마이크로리터의 100% 글리세롤을 극저온 바이알에 첨가한다. 장기 보관을 위해 바이알을 섭씨 영하 80도에서 동결하십시오.
갓 줄무늬가 있는 접시에서 식민지를 골라 삼부작 간장 국물 또는 영양 국물 5밀리리터에 접종합니다. 섭씨 30도에서 밤새 배양액을 200RPM으로 흔들면서 흡광도가 약 2에 도달할 때까지 배양액을 성장시킵니다. 다음날, 세포를 펠렛으로 만듭니다.
상청액을 버리고 2 밀리리터의 고압 증기 멸균 식염수로 펠렛을 두 번 세척하십시오. 세포를 다시 회전시킨 다음 펠릿을 2밀리리터의 액체 무탄소 기저 배지(LCFBM)에 다시 현탁하고 흡광도를 측정합니다. 다음으로, 두 개의 멸균 150밀리리터 삼각 플라스크를 대조군과 실험군에 대해 각각 A와 B로 표시합니다.
플라스크 A에 40 밀리리터의 LCFBM을 첨가 한 다음, 5 밀리몰 최종 농도의 스티렌을 첨가한다. 플라스크 B에 35 밀리리터의 LCFBM과 스티렌을 첨가하십시오. 그런 다음 약 0.1의 최종 흡광도로 세포 현탁액을 추가합니다.
LCFBM으로 플라스크 B의 부피를 40밀리리터로 올린 후, 두 플라스크를 섭씨 30도에서 30일 동안 200RPM으로 진탕하면서 배양합니다. 5일마다 각 플라스크의 흡광도를 측정하고 성장 곡선을 그립니다. 박테리아가 스티렌을 사용할 수 있는 경우 배양을 최대 45일까지 늘립니다.
흡광도의 증가는 박테리아가 스티렌을 대사할 수 있음을 나타냅니다. 그람 음성 박테리아에서 게놈 DNA를 분리하려면 단일 콜로니를 선택하여 멸균 시험관의 신선한 성장 배지에 접종합니다. 진탕 배양기에서 하룻밤 배양 후, 성장된 배양액 1.5 밀리리터를 펠렛으로 첨가한다.
상층액을 제거하고 펠릿을 200마이크로리터의 용해 완충액에 재현탁합니다. 그런 다음 66 마이크로 리터의 5 몰 염화나트륨 용액을 넣고 잘 섞는다. 생성된 혼합물을 원심분리한 후, 맑은 수피네이트를 신선한 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅하고, 동량의 클로로포름을 첨가한다.
유백색 용액이 관찰 될 때까지 용액을 여러 번 뒤집어 혼합하십시오. 튜브를 다시 돌리고 상층액을 깨끗한 바이알에 옮깁니다. 다음으로, 얼음처럼 차가운 100 % 에탄올 1 밀리리터를 첨가하고, DNA의 하얀 가닥이 침전 될 때까지 반전으로 혼합한다.
침전된 DNA를 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오. 펠릿을 70 % 에탄올 1 밀리리터로 세척하십시오.
세척물을 폐기한 후 DNA 펠릿을 실온에서 5분 동안 건조시킵니다. 건조되면 펠릿을 100 마이크로 리터의 Tris-EDTA 완충액에 다시 현탁시킵니다. 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정하고 1% 아가로스 겔에서 DNA를 실행하여 품질을 평가합니다.
균주를 식별하기 위해 박테리아에 대한 16S 리보솜 RNA 서열을 표적으로 하는 범용 프라이머를 사용하여 PCR로 순수 박테리아 배양에서 분리된 DNA를 증폭합니다. 얼음 위에 25 마이크로리터의 PCR 혼합물을 준비하고, 1 마이크로리터의 DNA 주형을 추가하고, 유전자 증폭을 위한 사이클링 조건을 설정한다. PCR 후, 5 마이크로 리터의 샘플을 5 배의 DNA 로딩 염료 1 마이크로 리터와 혼합한다.
그리고 증폭을 확인하기 위해 1% 아가로스 젤에 실행합니다. 16S 리보솜, rNA 유전자 시퀀싱의 경우, 앞서 설명한 것과 동일한 반응을 설정하지만 더 높은 부피로 설정합니다. 그런 다음 Sanger 시퀀싱을 위해 앰플리콘을 정제하기 위해 전체 샘플을 DNA 로딩 염료와 혼합하고 아가로스 겔에 로드하여 겔 추출 방법을 수행합니다.
시퀀싱이 완료되면 결과 파일을 더 빠른 형식으로 변환하고 NCBI의 BLAST 도구를 사용하여 시퀀스 유사성을 확인합니다. 인도 Dadri의 습지에서 채취한 물 샘플에서 분리된 박테리아 군집이 여기에 나와 있습니다. 분리된 박테리아는 액체 스티렌을 유일한 탄소 공급원으로 사용하여 각각의 배지에서 개별적으로 성장했습니다.
박테리아 분리주의 탄화수소 분해 가능성은 카테콜 분해 분석을 사용하여 평가되었습니다. 분리주 중 하나에 대한 대표적인 분석이 여기에 나와 있습니다. 게놈 DNA의 무결성은 아가로스 겔 상의 작은 DNA 샘플을 시각화함으로써 확인되었다.
그리고 16S 리보솜 rNA 유전자를 유니버셜 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 습지에서 분리된 엑시구오박테리움 균주와 알려진 엑시구오박테리움 종 사이의 관련성을 묘사하기 위해 계통수가 구성되었습니다. 프로토콜의 중요한 단계는 테스트 중인 기판의 활용도를 확인하는 것입니다.
성장 특성에 따라 미생물은 테스트 중인 기질을 활용하는 데 즉시 적응하지 못할 수 있으며 농축 과정이 필요할 수 있습니다. 이 방법은 환경 샘플에서 배양 가능한 박테리아 개체군에 중점을 둡니다. 연구원들은 탄화수소 분해와 관련된 유전자 및 경로에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 박테리아 전체 게놈 시퀀싱 및 대사 프로파일링과 같은 실험을 추가로 수행할 수 있습니다.
