עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות (HL115578 א Makino).

המחקר על העכברים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) מאוניברסיטת אריזונה בוצעה על פי המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב (NIH) הנחיות. הערה: סעיפים 1, 2 ו -3 צריכות להתבצע היום לפני הניסוי כפי התקנה. 1. פתרונות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ CD31 (50 מ&quot;ל) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מ&quot;ל 1 × חיץ מלוחים פוספט (PBS) כדי שפופרת 50 מ&quot;ל. לשקול 0.05 גרם שור סרום אלבומין (BSA) ו 0.037 גרם חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ולהוסיף הצינור 50 מ&quot;ל ולשים את הצינור כדי לסובב במשך כ 1 ח עד להמסת האבקה. התאם ל- pH 7.4, מסנן דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חדש 50 מ&quot;ל, ולאחסן ב 4 C עד השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) עם HEPES (500 מ&quot;ל) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.1915 גרם של HEPES לעשות 10 מ&quot;מ HEPES בתמיסה HBSS ומערבבים היטב. מדוד את pH ולהתאים ל -7.4. סנן ולאחסן ב 4ג. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון של 1x Kreb (1 ליטר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 מ&quot;ל של 10 × פתרון של Kreb [טבלה 1] להכפיל מים מזוקקים בבקבוק 1 ליטר. לשקול 2.1 גרם נתרן ביקרבונט ו -2 גרם D- גלוקוז ומוסיפים את הבקבוק. מערבבים ולהתאים את הנפח הכולל עד 1 ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון בועה עם 95% O 2/5% CO 2 גז במשך 30 דקות פתרון ולסנן בתוך מכסה המנוע. חנות ב 4 C ולשמור על הקרח במהלך הניסוי. </li></ol></li></ol> 2. הכנת החרוזים המגנטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל חיץ CD31 לתוך כל צינור 1.5 מ&quot;ל (צינור אחד לדגימה). מערבבים את החרוזים IgG אנטי עכברוש כבשים ולהוסיף את הכמות המתאימה מדגם [טבלה 1]. לנער את הצינורות במרץ 30 פעמים ומניחים אותם בצלחת מגנטי דקות 1 של טלטול. פתח את הצינורות בעוד על הצלחת ולזרוק פתרונות לדליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ CD31 1 מ&quot;ל לתוך צינור אחד. מוסיפים 2 עכברוש μl אנטי עכבר אנטי CD31הגוף על צינור אחד ולסובב צינורות O / N ב 4 ºC. </li></ol> 3. מעוקר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי כל כלי ניתוח וטיפים פיפטה. חותכים את הקצוות של טיפים פיפטה כך יש עצות עם 4 קטרים ​​שונים, מן הרחב אל הצר. בקטרים ​​משוערים על העצות הם 3 מ&quot;מ, 2.5 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ, ו -1.5 מ&quot;מ בהתאמה. חותך את טיפי חיטוי היום קודם לכן עם 30 דקות של עיקור בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס. הערה: סעיפים 4 - 11 צריך להתבצע ביום של הניסוי. </li></ol> 4. פתרונות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ כביסה המכיל 2% משורינת עגל סרום (IFCS) ב M199. עבור הדמיה, להכין 30 מ&quot;ל / עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אנזים (10 מ&quot;ל / לדוגמה). לשקול 0.6 יחידה / מ&quot;ל ​​של Dispase ו 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של Collagenase Type II לתוך צינור 50 מ&quot;ל. להוסיף M199 לסובב את הצינור ב 4 ºC במשך 15 דקות. סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חדש 50 מ&quot;ל insidדואר למכסה המנוע ולשמור על 4 C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן HBSS / HEPES עם הפרין. הוסף 10 מ&quot;ל של HBSS עם 10 HEPES מ&quot;מ ב 15 מ&quot;ל צינור. הוספת 100 μl של הפרין אל הצינור ולשמור על 4 C עד השימוש. </li></ol> 5. שטיפת חרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את הצינורות עם החרוזים מן הכתף ב 4 ºC ומביאים את מכסה המנוע. מניח את הצינורות בצלחת המגנטית ולנער דקות 1. דאמפ הפתרון ולהוסיף חיץ CD31 1 מ&quot;ל לתוך צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצינורות מתוך הצלחת המגנטית לנער במרץ 30 פעמים. שים את הצינורות בחזרה בצלחת המגנטית וחזור עבור סכום כולל של 3 שוטף. לאחר השלמת, לשים את הצינורות בחזרה 4C ולשמור מסתובבת עד השימוש. </li></ol> 6. Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את העכברים intraperitoneally עם 0.1 מ&quot;ל של הפרין כדי למנוע קרישת דם. המתן 10 דקות, ואז להרדים את העכברים באמצעות זריקה intraperitoneal של 0.01 מ&quot;ל של Pentobarbital. בדוק אם העכבר הוא מרגיש<html> כאב על ידי צובט את הרגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את העכבר על לוח קלקר עם ראש כלפי מעלה וחזק זרועות עם סיכות. שימוש במלקחיים ו-לגזור במספריים קשים לחתוך את העור באזור החזה העליון עד הגרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך במרכז כלוב הצלעות רק מעל הסרעפת. חותכים את העצם הצידה ולמעלה לכיוון הגרון כדי להפוך משולש לחשוף את הלב והריאות. חותכים את אבי העורקים בדיוק מעל הסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את התימוס עם מלקחיים ללא משייכת ולהשתמש מספריים לחתוך את כל רקמת חיבור בקפידה כדי לסלק ריאות ולב יחד. רקמות מקום בכוס עם 1 × Kreb של, לנער עם מלקחיים ולהעביר עד 6 צלחת ס&quot;מ עם 1 × Kreb של. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האונה של הריאות באמצעות מספרי מלקחיים. הכנס קטטר סטרילי 20 G לתוך אבי העורקים. שטוף את הדם במערכת הדם הכליליים עם HBSS / הפרין. ביצוע חתך קטן החדר, לנער את הלב ולהעביר לצינור מדגם של M199. שמור צינורות על הקרח. </li></ol><html> class = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. עיכול רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הלב אל צלחת 6 ס&quot;מ מלא 10 מ&quot;ל של תמיסת אנזים ופשטי- אותו לחתיכות קטנות באמצעות מספריים. מניחים את הכלים בחממה 37 ºC במשך 15 דקות. להתסיס חומרים מתעכל על ידי pipetting למעלה ולמטה 30 פעמים באמצעות טיפ עם הקצוות כדי לאפשר לרקמות לעבור קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את זה בחזרה בחממת 37 ºC עבור 15 דקות אחרות. חזרו על תסיסה שלוש פעמים, בכל פעם באמצעות טיפים פיפטה מהפתחים גדולים ביותר צרה ביותר ו -15 דגירה דקה בין כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 15 דקות האחרונות, לקחת דגימות החוצה לתוך מכסה המנוע. פתרון עד Pipet ולמטה 30 פעמים באמצעות טיפ pipet עם פתיחת הצרה ביותר ולהעביר דרך מסננת 40 מיקרומטר התא לתוך צינור חדש 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המנה עם כביסה חיץ 10 מ&quot;ל בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל ולהעביר על מסננת התא. שים את 50 מ&quot;ל צינורות בצנטריפוגה ספין ב 400 גרם במשך 10 דקות ב RT. </li></ol>itle &quot;&gt; 8. כביסה הצמדתי עם חרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant מבלי לשבש את הגלולה. שטפו תאים עם חיץ כביסה 5 מ&quot;ל פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל אחד בעבר הכינו צינורות 1.5 מ&quot;ל עם חרוזים ולעבוד על צינור אחד בכל פעם. שים צינור 1.5 מיליליטר אחד בצלחת המגנטית, לנער 3 פעמים ולפתוח אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה האחרון, להסיר supernatant ככל האפשר מבלי לשבש את הגלולה. לנתק את גושי תאים על ידי מצליף במרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ כביסה 1 מ&quot;ל צינור 50 מ&quot;ל ו לערבב את התאים עם טפטפת 1 מ&quot;ל. דאמפ הפתרון מהצינור 1.5 מ&quot;ל ולהוסיף 1 מ&quot;ל של תרחיף תאים מהצינור 50 מ&quot;ל של חרוזים. פליק הצינורות 30 פעמים ואז לסובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li></ol> 9. הכנות לקראת תרבית תאים / דימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תאי עבור תאי ציפוי. הוסף פתרון ג&#39;לטין (5% w / v, 300 μl) לתא היטב כדי לצפות את משטח דגירה במשך 30 דקות ב 37 ºC. לאחר דגירה, remג&#39;לטין אובה ויבש לפני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את הצינורות עם חרוזים / תאים לאחר 30 דקות של סיבוב ולשים בצלחת המגנטית בתוך מכסה המנוע. Shake למשך 2 דקות, מזבלה ולהוסיף חיץ כביסה 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו צינורות מתוך הצלחת, לנער במרץ 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. שים אותם בחזרה צלחת מגנטית ולנער דקות 1. חזור 4 פעמים עבור סכום כולל של 5 שטיפות, אבל עם 1 דקות רועדות על הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף האחרון, להוציא צינור אחד ולעבוד על כל אחד צינור בכל פעם. Shake 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. שים את זה על הצלחת המגנטית ולנער דקות 1. דאמפ ולהוסיף 1 מ&quot;ל 20% התקשורת IFCS EC (מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער במרץ 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. התאם pipet 500 μl ו pipet למעלה ולמטה 10 פעמים. העבר 500 μl לכל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים בבית חממה 37 ºC ולהשאיר O / N. למחרת, לשטוף תאים עם 10% תקשורת FBS EC. </li></ol> 10. הכנות לקראת דוגמאות כתם המערבי (WB) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טאקדואר את הצינורות עם חרוזים / תאים לאחר 1 hr סיבוב. שים אותם בצלחת המגנטית ולנער למשך 2 דקות. דאמפ supernatant ולהוסיף 1 מ&quot;ל HBSS קר. לנער במרץ 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. חזור פעמים עבור 3 שוטף, אבל עם 1 דקות רועדות על הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף האחרון, לשים צינורות בצלחת מגנטית ולנער דקות 1. הסר חוצץ באמצעות פיפטה lyse התאים עבור WB באמצעות שיטה שתוארה לעיל 11,12. lysate המצטבר בדרך כלל מכיל כ -30 מיקרוגרם של חלבון. </li></ol> הדמיה 11. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים 3 פעמים עם התקשורת, עם נפח סופי של 250 μl עבור תא. הוסף 1.5 μl של דיל-acLDL אל התאים. מנקודה זו, לשמור על התאים בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 3.5 שעות ב 37 ג. הוסף 1.5 μl של Hoechst, מערבבים היטב דגירה במשך 30 דקות ב 37 תאים ˚C.Wash עם PBS ולתקן עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם PBS ולחסום עם 5% BSA-PBS עבור 30 מילn ב RT. שטפו פעמיים עם 1% BSA-PBS. לדלל BS-לקטינים-FITC באמצעות 1% BSA-PBS לריכוז של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ולהוסיף 300 μl לכל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את התא על שייקר מסלולית ב RT במשך 30 דקות. לשטוף עם 3 פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם זמן חשיפה של 200 מילי-שניות עבור FITC (מכתים לקטינים, סמן EC, עירור / פליטה 488 ננומטר / 519 ננומטר), 30 msec עבור DAPI (Hoechst, עירור, מכתים גרעיני / פליטה ב 358 ננומטר / 461 ננומטר), ו -300 msec עבור TRITC (מכתים acLDL, סמן EC, עירור / פליטה ב 557 ננומטר / 576 ננומטר). לרכוש תמונות באמצעות עדשה אובייקטיבית 20X. </li></ol>

<ol><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell functions.</a> J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).</li>
<li>Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+focus%3A+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cells in focus: endothelial cell.</a> Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91, 3527-3561 (1998).</li>
<li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%3A+testing+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance.</a> Circulation. 115, 1285-1295 (2007).</li>
<li>Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+vascular+endothelial+cells+from+murine+heart+and+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung.</a> Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).</li>
<li>Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+connexin40+is+associated+with+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li>
<li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev Cell. 26, 204-219 (2013).</li>
<li>Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+pulmonary+endothelial+cells+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAcase+overexpression+reverses+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+type+1+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).</li>
<li>Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC%3A+old+protein+with+new+roles+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">VDAC: old protein with new roles in diabetes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

לתאי אנדותל ביותר בשימוש נרחב במחקר הם לתאי אנדותל אנושיים הטבור וריד (HUVECs) בגלל הנוחות וקלות culturing שלהם. עם זאת, הרבה מחקר דורש הזמינות של מודל פיסיולוגי שהשיג הבידוד של בתאי האנדותל מאיברים ספציפיים אחרים 10. תאי האנדותל לפצות אוכלוסיית קטין מאוד של תאים ברקמת ?...

מודלי עכבר של מחלות לב וכלי דם שונות והפרעות מטבוליות לשאת שינויים פיסיולוגיים ומולקולריים דומים לאלה שנמצאו בחולים. יתר על כן, שינוי גנטי של עכברים הוא כלי רב עוצמה המאפשר לנו לחקור את תפקיד פתוגניים של גנים ספציפיים בהתפתחות והתקדמות של מחלות. כיום, תאים מסוג הגן ספציפי-עקום או עכברים אאוט נוצרים בקלות במעבדות רבות ומדידת mRNA ורמות חלבון סוגי תאים מסוימים הוא הצעד הראשון בקביעה אם העכברים היו באמת מהונדסים גנטיים. האנדותל היא שכבה דקה אחת של תאי האנדותל (EC) המרפד את קיר כלי הדם הפנימי. תאי האנדותל ממלאים תפקיד קריטי בויסות מתח כלי דם, חדירות כלי דם, היווצרות כלי דם חדשה 1,2. תפקוד לקוי של האנדותל היא סימן ההיכר של מצבים פתולוגיים רבים ושינויים בתפקוד האנדותל יכול להוביל רכב שונים3,4 מחלות diovascular. זהו אפוא משמעותיים ללמוד את הפונקציה של תאי אנדותל בתנאים פיסיולוגיים pathophysiological. ישנן מספר דרכים כדי לבודד ECS 5-8 ואת שיטת הבידוד צריכה להיות מותאמת תלוי באיזה רקמות ומינים ישמשו. הסיבה לכך היא כי ECS מרקמות שונות להציג רמה גבוהה של ההטרוגניות ביחס סמני המשטח וביטוי חלבון שלהם 9. בידוד מוצלח של תאי אנדותל לעתים קרובות יכול להיות מאתגר ומחייבת מידה מסוימת של אימון ותרגול. לאחר שהושגה, שיטת הבידוד הציע בפרוטוקול זה מוכיח להיות יציב ויעיל. המטרה הכללית של שיטה זו היא להשיג עכבר הכליליים ECS (MCECs) באיכות גבוהה ובכמות. למרות כמות התאים שנאספה לב היא פחות תאים שנאספו מרקמות אחרות תוך שימוש בטכניקות אחרות, שיטה זו עדיין מספקת הימוראיכות ter. טוהר תאי אנדותל באוכלוסייה שתתקבל יהיה גדול מ -90%. לפיכך, טכניקה זו תהיה אידיאלית עבור יישומים המסתמכים על תאי האנדותל מבודדים גרידא כגון הדמית תא.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>SH3026801</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads pan mouse IgG beads&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD31 Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>IFCS&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>SH30072.04</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher</td><td>MT10060-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (Neutral Protease)</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS02109</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021-50 ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ml</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340-1 ml</td><td></td></tr><tr><td>Heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>D-Valine</td><td>Sigma</td><td>V1255-5G</td><td></td></tr><tr><td>EGS</td><td>Corning</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of mouse coronary endothelial cells

תאי האנדותל המרפדים את הדופן הפנימי של כלי דם יש תפקיד חשוב בוויסות של טון וסקולרית, חדירות כלי דם, היווצרות כלי דם חדשה. תפקוד לקוי של תא האנדותל הוא מעורב בהתפתחות והתקדמות של מחלות לב וכלי דם רבים, כולל מחלת לב איסכמית. כדי לבחון את הפונקציה ואפיון של תאי אנדותל כליליים, בידוד תא הוא הצעד הראשון וזה דורש טוהר וכמות גבוהים לערוך ניסויים הבאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לבודד תאי אנדותל כלילית עכבר בוגר. לב העכבר הוא גזור טחון לחתיכות קטנות. לאחר העיכול של הלב באמצעות dispase ו collagenase השנייה, התאים נשטפים וטופחו עם חרוזים מגנטיים אשר מצומדות עם נוגדנים נגד CD31. החרוזים עם תאי אנדותל נשטפים מספר פעמים והם מוכנים להשתמש ביישומים שונים, כולל הדמיה experime ביולוגית מולקולריתnts. בידוד יעיל בתשואה של כ 10 4 תאים לכל לב אחד עם מעל 90 טוהר%.

הבידוד המוצלח של תאי אנדותל כליליים מלב עכבר בדרך כלל מניב כ -10 4 תאים עם מעל 90 טוהר% עם צורה מרוצפת. עבור אוכלוסייה טהורה של תאי אנדותל, יש לנקוט זהירות בכל הפרוטוקול כדי להבטיח סביבת סטרילית חופשית מכל זיהום. הופעת תאים מוארכים או תאים מוגדלים ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

isolation-of-mouse-coronary-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  University of Arizona, Tucson. This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Video: Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

בידוד של תאי כלילית ותאים כליליים מהקיר החופשי של לב החולדה

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Developmental Biology

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Neuroscience

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Immunology and Infection

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in the endothelium at the transcriptomic and epigenomic levels, resulting in proatherogenic responses. Recently, single-cell RNA sequencing (scRNAseq) and single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) studies were performed to determine the transcriptomic and chromatin accessibility changes at a single-cell resolution using the mouse partial carotid ligation (PCL) model. As endothelial cells (ECs) represent a minor fraction of the total cell populations in the artery wall, a luminal digestion method was used to obtain EC-enriched single-cell preparations. For this study, mice were subjected to PCL surgery to induce d-flow in the left carotid artery (LCA) while using the right carotid artery (RCA) as a control. The carotid arteries were dissected out two days or two weeks post PCL surgery. The lumen of each carotid was subjected to collagenase digestion, and endothelial-enriched single cells or single nuclei were obtained. These single-cell and single-nuclei preparations were subsequently barcoded using a 10x Genomics microfluidic setup. The barcoded single-cells and single-nuclei were then utilized for RNA preparation, library generation, and sequencing on a high-throughput DNA sequencer. Post bioinformatics processing, the scRNAseq and scATACseq datasets identified various cell types from the luminal digestion, primarily consisting of ECs. Smooth muscle cells, fibroblasts, and immune cells were also present. This EC-enrichment method aided in understanding the effect of blood flow on the endothelium, which could have been difficult with the total artery digestion method. The EC-enriched single-cell preparation method can be used to perform single-cell omics studies in EC-knockouts and transgenic mice where the effect of blood flow on these genes has not been studied. Importantly, this technique can be adapted to isolate EC-enriched single cells from human artery explants to perform similar mechanistic studies.

We present a method for isolating endothelial cells and nuclei from the lumen of mouse carotid arteries exposed to stable or disturbed flow conditions to perform single-cell omics experiments.

בידוד תאי אנדותל מהלומן של עורקי הצוואר של עכברים לניסויים רב-תאיים חד-תאיים

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...