פרוטוקול זה מספק בסיס להרחבת תאי הגידול, אשר בתורו מאפשר מחקר מעמיק של תפקוד תאי הגידול ומצבים גנומיים. בנוסף, הוא מספק מערכת מודל במבחנה כדי להעריך את ההשפעה של הגידול על התגובה החיסונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת פרוטוקול מבוסס להקמת קווי גידול מזותל מרקמת המטופל.
אין כיום פרוטוקול סטנדרטי עבור מערכת מודל זו. ההיבט הקשה ביותר של טכניקה זו הוא נוכחות של זיהום פיברובלסטים בתרביות מעבר מוקדמות. זה קריטי שתהיה הבנה מוצקה של פיברובלסטים לעומת מורפולוגיה של תאי הגידול כדי לקבוע אם ניסיונות הרעב של פיברובלסטים עובדים.
התחילו בהעברת 10 מיליליטרים של קוקטייל אנזימטי לעיכול גידול לצינור דיסוציאציה. מעבירים את פיסת רקמת הגידול למכסה סטרילי בעל שש בארות באמצעות אזמל סטרילי. הסר את כל הרקמות הנמקיות השומניות וקרישי הדם באמצעות אזמל סטרילי חדש ומלקחיים.
חותכים את כל רקמת הגידול לרסיסים קטנים של מילימטר מעוקב אחד. כדי להבטיח שהרקמה לא תתייבש, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת המלח המאוזנת של האנק הסטרילי, או HBSS, לרקמת הגידול. העברת שברי הגידול לצינור הדיסוציאציה המכיל 10 מיליליטרים של קוקטייל אנזימטי לעיכול גידול.
סגור את הצינור בחוזקה. מניחים אותו בצד על דיסוציאטור הרקמה ומספקים חום לדיסוציאטור. בחר את ההגדרה המתוכנתת מראש על הדיסוציאטור לערכת הדיסוציאציה של גידול אנושי של 37 מעלות צלזיוס שנקבעה 1 ובדוק את המצב לאחר 10 דקות כדי לוודא שאין שגיאת סתימה מסומנת על ידי האור האדום המהבהב.
לאחר שעה, הסר את צינור הדיסוציאציה והנח אותו במכסה זרימה למינרי. סנן את הגידול המעוכל על ידי הנחת מסננת של 70 מיקרומטר על צינור חרוטי 50 מיליליטר וצנרת הגידול המעוכל באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר על המסנן. אם המסנן נתקע, עבור למסנן חדש.
יש לשטוף את צינור הדיסוציאציה ב-10 מיליליטרים של אמצעי עיכול טריים של הגידול ולשטוף את המסנן. הסר את המסנן והשלך אותו. הביאו את הנפח הכולל ל -40 מיליליטרים עם מדיום העיכול של הגידול.
צנטריפוגה ב 500 x g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות פיפטה שאפתנית של שני מיליליטר המחוברת למקור ואקום, שואפים את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור ומחזירים את התאים באמצעות 10 מיליליטרים של מדיום גידול סטרילי. ואז, שוב, צנטריפוגה על הצינורות ושואפים את הסופרנאטנט כפי שהודגם.
לאחר מכן, יש להחיות את התאים בשלושה מיליליטרים של מדיום גידול סטרילי ולהעביר את תרחיף התא לבאר אחת של צלחת סטרילית בעלת שש בארות. שמור את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות, מעבירים את המדיום המשומש מהגידול המעוכל בבאר אחת לבאר חדשה באותה צלחת של שש בארות, ואז מוסיפים שלושה מיליליטרים של מדיום גידול סטרילי לבאר אחת.
באמצעות מיקרוסקופ פאזה הפוך, לקבוע את אחוז הזיהום של פיברובלסטים בתרבית המעבר המוקדמת. אם זיהום הפיברובלסטים גדול מ-20% מהתאים בתרבית המעבר המוקדמת, המשיכו להתרבות לאחר החלפת מדיום הגידול במדיום הסרום המופחת. אם אוכלוסיית הפיברובלסטים אינה מצטמצמת ל-10% או פחות, יש לשטוף בעדינות את הבאר עם PBS כדי להסיר את הסרום המכיל את המדיום המכיל.
מוסיפים מיליליטר אחד של טריפסין לבאר בצלחת של שש בארות. מניחים את הצלחת או הבקבוקון של ששת הבארים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. הסר את הצלחת או הבקבוק מהאינקובטור ובדוק את הידבקות התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
כאשר התאים מתרוממים או צפים באופן חלקי, הסר בעדינות את התאים המרחפים וטריפסין בלבד. מקם את התאים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל נפח שווה או גדול יותר של מדיום גידול שלם. חזור על טריפסיניזציה עד שיוסרו שלושה עד ארבעה שברים.
צנטריפוגה של כל השברים העצמאיים ברזולוציה של 500 x גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות פיפטה שאפתנית של שני מיליליטר המחוברת למקור ואקום, שאפו את ה-supernatant מבלי להפריע לכדור. החייאת התאים באמצעות חמישה מיליליטרים של מדיום סרום מופחת סטרילי.
צלחת את התאים בבקבוק T-25 עבור כל שבר ומניחים את הצלוחיות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לצורך שימור בהקפאה של תאי מעבר מוקדמים, הפשרו שפופרת אחת של מדיום הקפאה אליקוטית. אסוף את התאים על ידי טריפסיניזציה על ידי שטיפת הצלחת תחילה עם PBS והוספת טריפסין כפי שהודגם בעבר.
מניחים את הבקבוקון באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. הסר את הבקבוקון מהאינקובטור ובדוק את הידבקות התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך. אם התאים מתרוממים או צפים, הסר בעדינות את התאים המרחפים ואת טריפסין.
מקם את התאים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל נפח שווה או גדול יותר של מדיום גידול שלם. מערבבים את תכולת הצינור על ידי צנרת בעדינות. הסר 20 מיקרוליטרים של תרחיף התא לצורך ספירה.
לאחר מכן צנטריפוגה את מתלה התא הנותר ב 500 x g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כאשר התאים מסתובבים, ספרו באמצעות פרוטוקול ספירה ספציפי למעבדה, כגון טריפאן כחול או אקריפין כתום/פרופידיום יודיד. בצעו שימוש חוזר בתאים לאחר צנטריפוגה במדיום הקפאה עם מינימום של 5 x 10 עד התאים השישיים למיליליטר של מדיום הקפאה והעבירו מיליליטר אחד של תרחיף תא זה ל-1.5 מיליליטר של קריוביאלים מסומנים מראש.
מניחים את הקריוביציאלים בתא הקפאת קצב מבוקר ומעבירים אותם מיד למינוס 80 מעלות צלזיוס. הנתון מראה זיהום מוגבר של 80%50% ו-30% בהשוואה לתרבית ללא זיהום פיברובלסטים. נתון זה מראה צביעת משטח ציטומטריה מייצגת של זרימה של ארבעה קווי גידול מזותליומה ראשוניים, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H וקו גידול מלנומה, MEL526 כבקרה שלילית.
קווי תאים אלה יכולים לבטא הן מזותלין והן N-cadherin. החשיבות של בדיקת ההשפעה של ניתוק אנזימטי על ביטוי סמני חלבון על פני השטח מוצגת גם מכיוון שגם טריפסין וגם תערובת הפרוטאז קולגן גרמו לאובדן ביטוי פני השטח של N-cadherin, בעוד ש-CD90 לא הושפע. שלבים חשובים כוללים עיבוד נכון של הגידול כולל הסרת דם ושומן לפני העיכול, זיהוי זיהום פיברובלסט וקביעה כיצד להגביל צמיחת יתר של פיברובלסטים היא חיונית.
שיטה חשובה בעקבות הליך זה כוללת מבחני לימפוציטים ציטוטוקסיים לבדיקת יכולתם של תאי T אוטולוגיים לזהות תאי גידול שמקורם בחולה. טכניקה זו תזהה קולטנים חדשים נגד תאי T ספציפיים לגידול שיכולים להיות בעלי חשיבות טיפולית. בנוסף, זה יאפשר לנו לחקור את האינטראקציה בין גידול לבין גידול מזווג מסתנן לימפוציטים ותפקוד לקוי של מערכת החיסון.
