עם פרוטוקול זה, הצגנו את השיטה הראשונה המסוגלת ליצור בו-זמנית פרופיל של שינויי RNA מרובים בתאי עצב בודדים, ולפתוח תחומי חקירה חדשים הכוללים ויסות פוסט-שעתוק בתאים בודדים. על ידי מינוף תנאי הכנת דגימות אופטימליים וספקטרומטריית מסות טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית, ניתן לזהות ולכמת יותר מתריסר נוקלאוזידים שעברו שינוי בנוירון יחיד לכל ניסוי. תאים בודדים שונים זה מזה מבחינת התפקודים שלהם, המורפולוגיה והפרופילים הכימיים שלהם.
חשוב שנוכל למדוד את הפסיפס הכימי השלם של התאים האלה, כולל פרופילי הרנ"א שלהם, כדי שיהיו מספיק תאים שיבינו את ההבדלים ביניהם, הן בבריאות והן במחלות. היקף הכנת הגרעינים לפני בידוד נוירונים בודדים תלוי בהעדפות של האדם המבצע את הבידוד. נסו טיפולי פרוטאזות ארוכים וקצרים יותר כדי לזהות מצבים מתאימים.
כדי להתחיל, מניחים את הצד הגחוני של Aplysia californica המרדים למעלה במגש ניתוח. התחילו לנתח אותו באמצעות מספריים כירורגיים כשקצה קהה אחד ממוקם לכיוון החיה ומבצעים בזהירות חתך אורכי דרך כף הרגל. לאחר הצמדת הצדדים הרוסטרליים, הקאודליים והרוחביים של גוף החיה כדי לחשוף את האיברים הפנימיים ואת הגרעינים המרכזיים של מערכת העצבים בחלל הגוף, בודדו את הגרעינים העיקריים של מערכת העצבים המרכזית מהחיה על ידי ניתוק כירורגי של עצבים וכמה חיבורים שמקורם בגרעינים.
לטבול את הגרעינים ב 10 מיליגרם לכל מיליליטר פרוטאז סוג תמיסה XIV מ Streptomyces griseus ולדגום במשך 30 דקות עד שעה אחת ב 34 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את הגרעינים שש פעמים עם תמיסה אנטיביוטית מלאכותית של מי ים. לאחר מכן באמצעות פיפטת העברת פוליפרופילן שנחתכה לפתח של חמישה מילימטרים, מעבירים את כל הגרעינים לתוך צלחת מצופה פולימר סיליקון מלאה בתמיסה האנטיביוטית המלאכותית של מי ים.
שמור על הגרעינים תמיד שקועים במי ים מלאכותיים. לאחר מכן, כדי להסיר את נדן הגנגליון, להצמיד את הגרעינים ולהשתמש microscissors ומלקחיים עדינים. עם טיפול אנזימטי חזק מספיק, השתמש במחטים זכוכית או מתכת לצורך התרת הרסן.
לזהות חזותית את הנוירונים המעניינים. באמצעות נימי זכוכית מרוכזים או מחטי טונגסטן חדות, מבודדים בזהירות את התא המזוהה מהגנגליון הגדול. לאחר שאיבת מיקרוליטר אחד של מי ים מלאכותיים למיקרופיפט פלסטיק, העבירו את התא המבודד לתוך צינור דגימת PCR המכיל ארבעה מיקרוליטרים של 0.365 אמוניום אצטט טוחן.
לצורך מדידות ריקות, אספו חמישה אליקוטים מיקרוליטרים של תמיסת האנטיביוטיקה של מי הים המלאכותיים מהתבשיל המכיל את הגנגליון וערבבו עם מאגר העיכול. ליז את הנוירונים המבודדים על ידי שאיפה חוזרת ונשנית ולוותר על מיקרופיפט ב 0.365 אמוניום אצטט טוחן. ייתכן שתאים מסוימים לא ייקרעו מיד.
כדי לשקר אותם, הפעילו לחץ על פני קוטר התא עם נימי זכוכית מרוכזים. לאחר מכן, מחממים את הדגימה במחזור תרמי לפני הוספת 3.375 מיקרוליטרים של מאגר עיכול RNA לדגימה. ערבבו פתרון זה באמצעות מיקרופיפט על ידי משיכה וחלוקה של הפתרון מספר פעמים.
סובבו כלפי מטה את כל הטיפות הנוזליות הנצמדות לדפנות צינור ה-PCR באמצעות צנטריפוגה עליונה של ספסל מיניאטורי. לאחר מכן דוגרים את הדגימות במחזור התרמי ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות, ולאחר מכן החזקה ב 10 מעלות צלזיוס עם המכסה המחומם מוגדר על On.לאחר שהדגימות התקררו, מיד להעביר שבעה מיקרוליטרים של התמיסה לתוך בקבוקון autosampler מצויד בתוספת 250 microliter ללא כל היווצרות בועות בצינור autosampler. כדי להכין את מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית להפרדת הנוקלאוזידים הקנוניים והמשתנים, שיווי המשקל של עמודת C18 באמצעות 99% פאזה ניידת A ו-1% פאזה ניידת B בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר לדקה למשך 12 דקות ב-36 מעלות צלזיוס.
הפעל את מכשיר ספקטרומטריית המסה במצב חיובי כאשר שסתום הסטייה מוגדר לבזבוז במשך שתי הדקות הראשונות של הניתוח ולמקור להמשך הריצה. לאחר מכן אספו ספקטרום מסה על פני טווח m/z של 110 עד 600. בחר יונים לדיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות ב-35 עד 40 וולט אלקטרונים במשך שלוש שניות באמצעות רשימת מסות מועדפת שנבנתה ממסד הנתונים וחלון בידוד של 0.5.
השתמש בהדרה פעילה כדי לא לכלול יונים מפיצול לאחר שלושה ספקטרום. הגדרת רכישה דינמית של ספקטרום MS/MS עבור יונים עם עוצמות מעל ומתחת ל-50, 000 ספירות בארבעה הרץ והרץ אחד, בהתאמה. וסף מינימלי לבחירת יונים ב 1, 990 ספירות.
עבור ניתוח כמותי של שינוי RNA של נוירון יחיד על ידי ספקטרומטריית מסה, בנה עקומות כיול באמצעות אזורי שיא כרומטוגרמה של יונים שחולצו, המתקבלים עבור תקני נוקלאוזידים מותאמים בחמישה ריכוזים לפחות כדי לאפשר אינטרפולציה של ריכוזי אנאליטים אנדוגניים לא ידועים. ניתוח שינוי RNA של נוירון יחיד על ידי ספקטרומטריית מסה כולל בידוד ידני של נוירונים מזוהים לנפחי דגימה קטנים לעיכול ליזה וניתוח LC-MS/MS. ניתוח שינוי RNA של נוירון יחיד על ידי ספקטרומטריית מסה זיהה באופן שגרתי למעלה מתריסר שינויי RNA בתאי עצב בודדים ממערכת העצבים המרכזית של Aplysia californica המייצגים כיסוי של כמעט מחצית מהאפיטרנקטום הידוע של חיה זו בתא יחיד.
התוצאות גילו לראשונה כי פרופילי שינוי RNA של תאים בודדים עלולים לסטות מתאים בתפזורת באותה רקמה. תמיכה נוספת בתבניות נוקלאוזידים ייחודיות שעברו שינוי התקבלה מקבוצה נפרדת של בעלי חיים שבה בוצעו השוואות זוגיות עבור 13 שינויי RNA, שזוהו בדרך כלל הן בתאי העצב הבודדים והן ברקמה בתפזורת. שינויי RNA בתאים שונים מבחינה תפקודית יצרו אשכולות ייחודיים בחלקת הניקוד בעוד שתאי עצב הומולוגיים מסוג R2/LPl1 התקבצו יחד.
עלילת ההעמסה מראה כי ההבדלים הונעו בעיקר על ידי שפע האיזומרים המיקוםיים של מתיל-אדנוזין, כולל 2'O-מתיל-אדנוזין ו-N1-מתיל-אדנוזין. עקומות כיול חיצוניות נוצרו עבור N1-מתיל-אדנוזין, פסאודורידין, 2'O-מתילגואנוסין, 2'O-מתיל-אדנוזין ו-N6-דימתיל-אדנוזין. וכמותו של כל נוקלאוזיד שהשתנה בתאים המטא-צנטרבריים ובזוגות תאי R2/LPl1 נקבעה על ידי אינטרפולציה.
ודא כי נפח מינימלי של מי ים מלאכותיים מועבר לתוך צינור PCR יחד עם הנוירון המבודד היחיד. זה ממזער את דילול הדגימה, מה שבסופו של דבר משפיע על זיהוי האנליטים. פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר התפלגויות של שינויי רנ"א במבנים תת-תאיים, כמו אקסונים ודנדריטים, כדי לשפר את ההבנה של המנגנונים של תרגום מקומי תלוי פעילות.
