טרנספקציה של תאי HEK293T חייבת להתבצע במפגש של 90%. כמו כן, השימוש במסנן קשירת חלבון נמוך של 0.45 מיקרון לסינון וקטורים לנטי-ויראליים ושימוש בכרית סוכרוז לצורך אולטרה-צנטריפוגציה הם חיוניים. התחילו על ידי גידול תאי HEK293T במדיום DMEM המכיל 10%FBS ו-1X פניצילין סטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם אטמוספירה של 5% פחמן דו-חמצני ו-21% חמצן עד שהתאים מגיעים למפגש של 90% לפני הזריעה לטרנספקציה.
זרעו ארבע פעמים 10 עד ששת התאים ב-10 מיליליטרים של מדיום גדילה מלא בצלחת תרבית רקמה של 100 מילימטר וגדלים בן לילה בחממת תרביות רקמה לחה עם אטמוספירה של 5% פחמן דו-חמצני ו-21% חמצן. עבור כל טרנספקציה, דיללו מיליגרם אחד למיליליטר של מלאי דנ"א פלסמידי במיליליטר אחד של מדיית DMEM נטולת סרום בצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר על ידי מעקב אחר היחס בין פלסמידי הכניסה והאריזה כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט. מערבולת את הצינור במשך 10 שניות ומסובבים ב-10, 000 פעמים G למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף.
לאחר מכן, הוסף 70 microliters של מיליגרם אחד לכל מיליליטר תמיסת מלאי של פוליאתילן פולימרי, או PEI, לצינור. שוב, מערבולת ולסובב בקצרה את הצינור. עבור טרנסקציה מבוססת ליפופקטאמין, דיללו את הווקטורים ב-500 מיקרוליטרים של מדיית DMEM נטולת סרום המכילה 45 מיקרוליטרים של ריאגנט P המסופקים בערכה.
לאחר מכן, לדלל 70 מיקרוליטרים של ריאגנט L באמצעות 500 מיקרוליטרים של אותו מדיום. דגירה של שני הצינורות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, שלבו את התוכן של שני הצינורות והדגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות כדי לאפשר היווצרות מורכבת.
לאחר מכן, הוסיפו לצלחת מיליליטר אחד של קומפלקסים של דנ"א PEI או דנ"א ליפופקטאמין המכילים דנ"א, ודגרו במשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% פחמן דו-חמצני ו-21% חמצן. לאחר הדגירה, החליפו את המדיה ב-10 מיליליטרים של מדיית צמיחה מלאה ורעננה והחזירו את הצלחת לחממה. לאחר יומיים של טרנספקציה, אספו את המדיה המכילה את הנגיף והוסיפו את התאים ל-10 מיליליטרים של מדיית גדילה מלאה ורעננה.
שוב, לאחר שלושה ימים של טרנספקציה, אספו את המדיה המכילה את הנגיף ושלבו אותה עם אמצעי התקשורת שנאספו בנקודת הזמן של היומיים. צנטריפוגה את הסופרנטנט הנגיפי ב 2, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לכדור פסולת סלולרית. סנן את ה-supernatant באמצעות מסנן קשירה בעל נקבוביות של 0.45 מיקרון בגודל נמוך של חלבון ומאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן ל-ultracentrifugation.
עיקרו את הכוסות המחזיקות את הצינורות האולטרה-צנטריפוגים על ידי שטיפה עם 70% אתנול למשך 10 דקות. אוויר יבש, סגור, ומניח את הכוסות על ארבע מעלות צלזיוס. הוסיפו 36 מיליליטרים במדיה מסוננת המכילה חלקיקים לנטי-ויראליים לצינור אולטרה-צנטריפוג' סטרילי.
יש למלא חמישה מיליליטרים של חשפנית סטרילית בארבעה מיליליטרים של תמיסת סוכרוז סטרילית 20% שהוכנה ב-PBS ולחלק אותה לתחתית הצינור המכיל וקטורים לנטי-ויראליים, או LVS. ודא כי הפתרון סוכרוז לא צריך להיות מעורבב עם המדיה ועושה שיפוע בתחתית הצינור. אזנו את כל צינורות האולטרה-צנטריפוג' באמצעות מדיית DMEM ללא סרום, הניחו את הצינורות בצינורות אולטרה-סנטריפוג קרים המחזיקים כוסות וסגרו את המכסים.
סובבו את הצינורות ב-125, 000 פעמים G במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, יש להשליך בזהירות את ה-supernatant על-ידי היפוך תכולת הצינור במיכל המכיל אקונומיקה מבלי להפריע לכדור. סמן את הכדור אם הוא גלוי לעין.
מניחים את הצינור האולטרה-צנטריפוג' בצינור סטרילי של 50 מיליליטר ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של DPBS סטרילי בחלק העליון של הכדור. מניחים את הצינור בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, ערבבו בעדינות את תכולת הצינור על ידי צנרת למעלה ולמטה לפני סיבוב של 13, 000 פעמים G בצנטריפוגה שולחנית כדי לכדור כל פסולת.
מעבירים את ה-supernatant לצינור חדש ומעבירים את ההכנה לנגיף. לבסוף, אחסן את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הטרנספקציה, נצפה ביטוי GFP בשפע בתאי HEK293T.
הביטוי של חלבונים נגיפיים הביא להיווצרות סינקטיה של תאי HEK293T שבהם מתמזגים תאים בודדים. בעקבות ההדבקה נצפתה ביטוי ניכר של GFP גם בתאי אב עצביים נגועים בנגיף. מדידת LVS titer בין הריאגנט PEI בעלות נמוכה לליפופקטמין 3000 לא הראתה הבדל משמעותי בטיטר הנגיפי.
הטיטרים הוויראליים עבור וקטורים מבוססי PLK 0.1 מוצגים כאן. תאים שעברו טרנספקטציה לנטי-ויראלית הראו יותר מ-80% כדאיות תאים בהשוואה לתאים שאינם מותמרים, בעוד שאף אחד מהתאים לא שרד את הטיפול. ניתוח כתמים מערבי הראה ביטוי שופע של L-2-הידרוקסיגלוטרט דהידרוגנאז בתאים שעברו התמרה עם עמוד שדרה וקטורי ריק.
עם זאת, לא נצפתה הבעה בתאים שהומרו עם וקטור הנושא רנ"א קצרים עם סיכות שיער. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש בפולימר קטיוני בעלות נמוכה פוליאתילן פולימרי כדי לייצר חלקיקים lentiviral על ידי טרנספקציה משותפת של תאי HEK293T באמצעות וקטורים כניסה ואריזה.
