HEK293T細胞のトランスフェクションは、90%コンフルエントで行わなければならない。また、レンチウイルスベクターろ過用の0.45ミクロンの低タンパク質結合フィルターの使用および超遠心分離用のスクロースクッションの使用も不可欠です。HEK293T細胞を、10%FBSおよび1Xペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM培地中で、5%二酸化炭素および21%酸素の雰囲気の加湿インキュベーター内で、トランスフェクションのために播種する前に細胞が90%コンフルエンシーに達するまで摂氏37度で培養することから始めます。
100ミリメートルの組織培養プレート中の10ミリリットルの完全な増殖培地中の6つの細胞を4回10回シードし、5%二酸化炭素および21%酸素の雰囲気を有する加湿組織培養インキュベーター内で一晩増殖させる。トランスフェクションごとに、テキスト原稿に記載されているエントリープラスミドとパッケージングプラスミドの比率に従って、1.5ミリリットル遠心チューブ内の無血清DMEM培地1ミリリットル中のプラスミドDNAストック1ミリリットルあたり1ミリグラムを希釈します。チューブを10秒間ボルテックスし、室温で30秒間Gを10,000回で回転させて集めた。
次に、ポリマーポリエチレンイミン(PEI)の原液1ミリリットルあたり1ミリグラムの70マイクロリットルをチューブに加える。再び、渦を巻き、チューブを短時間回転させる。リポフェクタミンベースのトランセクションの場合、ベクターを、キットに供給される45マイクロリットルの試薬Pを含む500マイクロリットルの無血清DMEM培地で希釈する。
次いで、500マイクロリットルの同じ培地を用いて70マイクロリットルの試薬Lを希釈する。両方のチューブを室温で5分間インキュベートする。次いで、両方のチューブの内容物を結合し、室温で20分間インキュベートして複合体形成を可能にする。
次に、細胞を含むプレートにDNA PEIまたはDNAリポフェクタミン複合体を1ミリリットル滴下し、5%二酸化炭素および21%酸素の雰囲気下で摂氏37度で6時間インキュベートする。インキュベーション後、培地を10ミリリットルの新鮮な完全成長培地と交換し、プレートをインキュベーターに戻します。トランスフェクションの2日後、ウイルス含有培地を収集し、10ミリリットルの新鮮な完全増殖培地で細胞を重ね合わせます。
ここでも、トランスフェクションの3日後、ウイルス含有培地を収集し、2日間の時点で収集された培地と組み合わせる。ウイルス上清を2, 000倍Gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞破片をペレット化する。0.45ミクロンの孔径の低いタンパク質結合フィルターを使用して上清をろ過し、超遠心分離の準備ができるまで摂氏4度で保存します。
超遠心チューブの保持カップを70%エタノールで10分間洗浄して滅菌します。カップを風乾し、閉じて、摂氏4度に置きます。レンチウイルス粒子を含む濾過培地で36ミリリットルを滅菌超遠心チューブに加える。
5ミリリットルの滅菌ストリペットをPBSで調製した4ミリリットルの滅菌20%スクロース溶液で満たし、レンチウイルスベクターまたはLVSを含むチューブの底に分配する。スクロース溶液を媒体と混合してはならず、チューブの底に勾配を作るようにしてください。無血清DMEM培地を使用してすべての超遠心チューブのバランスを取り、チューブを冷たい超遠心チューブ保持カップに入れ、蓋を閉めます。
チューブを125, 000倍のGで4°Cで2時間回転させます。スピン後、ペレットを乱すことなく漂白剤を入れた容器にチューブの内容物を反転させて上清を慎重に捨てる。ペレットが表示されている場合はマークを付けます。
超遠心チューブを50ミリリットルの滅菌チューブに入れ、ペレットの上部に200マイクロリットルの滅菌DPBSを加える。一晩でチューブを摂氏4度に置きます。翌日、卓上遠心分離機で13,000倍Gで回転する前に、チューブの内容物を上下にピペッティングして穏やかに混合し、破片をペレット化する。
上清を新しいチューブに移し、ウイルス調製物をアリコートする。最後に、チューブをマイナス80°Cで保管します。トランスフェクション後、HEK293T細胞において豊富なGFP発現が観察された。
ウイルスタンパク質の発現は、単一細胞が融合したHEK293T細胞の合胞体形成をもたらした。感染後、ウイルス感染神経前駆細胞においてもGFPの顕著な発現が観察された。低コストPEIとリポフェクタミン3000試薬との間のLVS力価測定は、ウイルス力価に有意差を示さなかった。
PLK 0.1ベースのベクターのウイルス力価をここに示します。レンチウイルス形質移入細胞は、非形質導入細胞と比較して80%以上の細胞生存率を示したが、治療を生き延びた細胞はなかった。ウェスタンブロット分析は、空のベクター骨格で形質導入された細胞におけるL-2-ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの豊富な発現を示した。
しかしながら、短いヘアピン型RNAを有するベクターで形質導入された細胞では発現は認められなかった。この技術の主な利点は、低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミンを使用して、エントリーベクターおよびパッケージングベクターを使用してHEK293T細胞を同時トランスフェクトすることによってレンチウイルス粒子を製造することです。
