La transfection des cellules HEK293T doit être effectuée à 90 % de confluence. En outre, l’utilisation d’un filtre à faible teneur en protéines de 0,45 micron pour la filtration vectorielle lentiviral et l’utilisation d’un coussin de saccharose pour l’ultracentrifugation sont essentielles. Commencez par cultiver des cellules HEK293T dans un milieu DMEM contenant 10% de FBS et 1X de streptomycine de pénicilline à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de dioxyde de carbone et 21% d’oxygène jusqu’à ce que les cellules atteignent 90% de confluence avant l’ensemencement pour la transfection.
Ensemencez quatre fois 10 aux six cellules dans 10 millilitres de milieu de croissance complet dans une plaque de culture tissulaire de 100 millimètres et cultivez pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire humidifié avec une atmosphère de 5% de dioxyde de carbone et 21% d’oxygène. Pour chaque transfection, diluer un milligramme par millilitre de stocks d’ADN plasmidique dans un millilitre de milieu DMEM sans sérum dans des tubes centrifuges de 1,5 millilitre en suivant le rapport entre les plasmides d’entrée et d’emballage décrits dans le manuscrit textuel. Vortex le tube pendant 10 secondes et rotation à 10 000 fois G pendant 30 secondes à température ambiante pour recueillir.
Ensuite, ajoutez 70 microlitres d’un milligramme par millilitre de solution mère de polyéthylèneimine polymère, ou PEI, au tube. Encore une fois, vortex et brièvement faire tourner le tube. Pour la transsection à base de lipofectamine, diluer les vecteurs dans 500 microlitres de milieux DMEM sans sérum contenant 45 microlitres de réactif P fournis dans le kit.
Ensuite, diluer 70 microlitres de réactif L en utilisant 500 microlitres du même milieu. Incuber les deux tubes à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, combinez le contenu des deux tubes et incubez à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre une formation complexe.
Ensuite, ajoutez un millilitre d’ADN PEI ou de complexes d’ADN lipofectamine à la plaque contenant des cellules et incubez pendant six heures à 37 degrés Celsius avec une atmosphère de 5% de dioxyde de carbone et 21% d’oxygène. Après l’incubation, remplacez le milieu par 10 millilitres de milieu de croissance complet frais et retournez la plaque à l’incubateur. Après deux jours de transfection, prélever le milieu contenant le virus et superposer les cellules avec 10 millilitres de milieu de croissance complet frais.
Encore une fois, après trois jours de transfection, collectez le milieu contenant le virus et combinez-le avec le milieu recueilli au point de temps de deux jours. Centrifuger le surnageant viral à 2 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les débris cellulaires. Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre à faible liaison aux protéines de 0,45 micron de taille de pore et conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’ultracentrifugation.
Stériliser les gobelets de maintien des tubes d’ultracentrifugation en les lavant à 70% d’éthanol pendant 10 minutes. Sécher à l’air, fermer et placer les tasses à quatre degrés Celsius. Ajouter 36 millilitres au milieu filtré contenant des particules lentivirales à un tube ultracentrifuge stérile.
Remplir cinq millilitres d’une stripette stérile avec quatre millilitres de solution stérile de saccharose à 20% préparée dans du PBS et la distribuer au fond du tube contenant des vecteurs lentiviraux, ou LVS. Assurez-vous que la solution de saccharose ne doit pas être mélangée avec le milieu et fait un gradient au fond du tube. Équilibrez tous les tubes d’ultracentrifugation à l’aide d’un média DMEM sans sérum, placez les tubes dans des gobelets de maintien de tubes d’ultracentrifugation froids et fermez les couvercles.
Faites tourner les tubes à 125 000 fois G pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Après la rotation, jetez soigneusement le surnageant en inversant le contenu du tube dans un récipient contenant de l’eau de Javel sans perturber la pastille. Marquez la pastille si elle est visible.
Placez le tube ultracentrifuge dans un tube stérile de 50 millilitres et ajoutez 200 microlitres de DPBS stérile au sommet de la pastille. Placez le tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, mélanger doucement le contenu d’un tube en pipetant de haut en bas avant de tourner à 13 000 fois G dans une centrifugeuse de table pour granuler les débris.
Transférer le surnageant dans un nouveau tube et aliquoter la préparation du virus. Enfin, stockez les tubes à moins 80 degrés Celsius. Après la transfection, une expression abondante de GFP a été observée dans les cellules HEK293T.
L’expression de protéines virales a entraîné la formation de syncytie de cellules HEK293T où des cellules individuelles sont fusionnées. Après l’infection, une expression marquée de GFP a également été observée dans les cellules progénitrices neurales infectées par le virus. La mesure du titre LVS entre le réactif PEI et lipofectamine 3000 à faible coût n’a pas montré de différence significative dans le titre viral.
Les titres viraux pour les vecteurs basés sur PLK 0.1 sont montrés ici. Les cellules transfectées lentivirales ont montré une viabilité cellulaire de plus de 80% par rapport aux cellules non transduites, alors qu’aucune cellule n’a survécu au traitement. L’analyse par transfert de Western a montré une expression abondante de L-2-hydroxyglutarate déshydrogénase dans des cellules transduites avec une colonne vertébrale vectorielle vide.
Cependant, aucune expression n’a été observée dans les cellules transduites avec un vecteur porteur d’ARN courts en épingle à cheveux. Le principal avantage de cette technique est l’utilisation de polyéthylèneimine polymère cationique à faible coût pour produire des particules lentivirales en co-transfectant des cellules HEK293T à l’aide de vecteurs d’entrée et d’emballage.
