HEK293T 세포의 형질감염은 90% 컨플루언시에서 수행되어야 한다. 또한, 렌티바이러스 벡터 여과를 위한 0.45-미크론 저단백 결합 필터의 사용과 초원심분리를 위한 수크로오스 쿠션의 사용이 필수적이다. HEK293T 세포를 트랜스펙션을 위해 시딩하기 전에 세포가 90%confluency에 도달할 때까지 5% 이산화탄소 및 21% 산소의 분위기로 가습된 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 10%FBS 및 1X 페니실린 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 배양함으로써 시작하십시오.
여섯 개의 세포를 100밀리미터 조직 배양 플레이트에서 10밀리리터의 완전한 성장 배지에 네 번 10번 시드하고, 5% 이산화탄소 및 21%산소의 대기를 갖는 가습 조직 배양 배양기에서 밤새 성장시킨다. 각 형질감염에 대해, 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 입력 및 패키징 플라스미드의 비율에 따라 1.5밀리리터 원심분리 튜브의 무혈청 DMEM 배지 1밀리리터에 플라스미드 DNA 스톡을 밀리리터당 1밀리그램씩 희석한다. 튜브를 10초 동안 볼텍스하고 실온에서 30초 동안 10, 000배 G에서 회전시켜 수집한다.
그런 다음 폴리머 폴리에틸렌 이민 또는 PEI의 밀리리터 원액 당 70 마이크로 리터의 1 밀리그램을 튜브에 첨가하십시오. 다시 와류하고 튜브를 간단히 회전시킵니다. 리포펙타민계 횡단의 경우, 키트에 공급된 45 마이크로리터의 시약 P를 함유하는 무혈청 DMEM 배지 500 마이크로리터에 벡터를 희석한다.
이어서, 500 마이크로리터의 동일한 매질을 사용하여 70 마이크로리터의 시약 L을 희석한다. 두 튜브를 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 두 튜브의 내용물을 결합하고 복잡한 형성을 허용하기 위해 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하십시오.
다음으로, DNA PEI 또는 DNA 리포펙타민 복합체 1밀리리터를 세포를 함유하는 플레이트에 적하하고, 5%이산화탄소 및 21% 산소의 분위기로 섭씨 37도에서 6시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 배지를 10 밀리리터의 신선한 완전 성장 배지로 교체하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 형질감염 이틀 후, 바이러스 함유 배지를 수집하고 세포를 10 밀리리터의 신선한 완전한 성장 배지로 오버레이한다.
다시, 형질감염의 사흘 후에, 바이러스 함유 배지를 수집하고 이틀 시점에서 수집된 배지와 결합시킨다. 바이러스 상층액을 섭씨 4도에서 10분 동안 2, 000배 G에서 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화한다. 0.45-마이크론 공극 크기 저단백질 결합 필터를 사용하여 상층액을 여과하고, 초원심분리가 준비될 때까지 섭씨 4도에서 보관한다.
초원심분리 튜브의 유지 컵을 70% 에탄올로 10분 동안 세척하여 멸균합니다. 공기를 말리고, 닫고, 컵을 섭씨 네 도에 놓습니다. 렌티바이러스 입자가 포함된 여과된 배지에 36밀리리터를 멸균 초원심분리 튜브에 첨가합니다.
PBS로 준비된 네 밀리리터의 멸균 20%수크로오스 용액으로 멸균 스트리펫 다섯 밀리리터를 채우고 렌티바이러스 벡터 또는 LVS가 들어있는 튜브의 바닥에 분배한다. 자당 용액이 매체와 혼합되어서는 안되며 튜브 바닥에 구배를 만듭니다. 무혈청 DMEM 배지를 사용하여 모든 초원심분리 튜브의 균형을 맞추고, 튜브를 컵을 고정하는 차가운 초원심분리 튜브에 넣고, 뚜껑을 닫습니다.
튜브를 섭씨 네 도에서 두 시간 동안 125, 000 배 G로 돌립니다. 스핀 후, 펠렛을 방해하지 않고 표백제가 들어있는 용기에 튜브의 내용물을 뒤집어 조심스럽게 상층액을 버립니다. 펠릿이 보이면 표시하십시오.
초원심분리 튜브를 50 밀리리터 멸균 튜브에 넣고 펠릿 상단에 200 마이크로 리터의 멸균 DPBS를 첨가하십시오. 튜브를 하룻밤 사이에 섭씨 네 도에 놓습니다. 다음날, 탁상용 원심분리기에서 13, 000배 G로 방사하기 전에 튜브의 내용물을 상하로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하여 이물질을 펠릿화한다.
상청액을 새로운 튜브로 옮기고 바이러스 제제를 분취합니다. 마지막으로 튜브를 영하 80도에 보관하십시오. 형질감염 후, HEK293T 세포에서 풍부한 GFP 발현이 관찰되었다.
바이러스 단백질의 발현은 단일 세포가 융합되는 HEK293T 세포의 동기화 형성을 초래했다. 감염 후, GFP의 현저한 발현은 또한 바이러스-감염된 신경 전구 세포에서 관찰되었다. 저가 PEI와 리포펙타민 3000 시약 사이의 LVS 역가 측정은 바이러스 역가에서 유의한 차이를 나타내지 않았다.
PLK 0.1-기반 벡터에 대한 바이러스 역가가 여기에 제시되어 있다. 렌티바이러스 형질감염된 세포는 형질도입되지 않은 세포와 비교하여 80% 이상의 세포 생존율을 보인 반면, 어떤 세포도 처리에서 살아남지 못했다. 웨스턴 블롯 분석은 빈 벡터 백본으로 형질도입된 세포에서 L-2-하이드록시글루타레이트 탈수소효소의 풍부한 발현을 보여주었다.
그러나, 짧은 헤어핀 RNA를 운반하는 벡터로 형질도입된 세포에서는 발현이 관찰되지 않았다. 이 기술의 주요 장점은 진입 및 포장 벡터를 사용하여 HEK293T 세포를 공동 형질감염시킴으로써 렌티바이러스 입자를 생산하기 위해 저가의 양이온성 중합체 폴리에틸렌이민을 사용하는 것이다.
