HEK293T hücrelerinin transfeksiyonu% 90 oranında yapılmalıdır. Ayrıca, lentiviral vektör filtrasyonu için 0.45 mikron düşük protein bağlayıcı filtrenin kullanılması ve ultrasantrifüjleme için bir sakkaroz yastığının kullanılması esastır. HEK293T hücrelerini, 37 santigrat derecede %10 FBS ve 1X penisilin streptomisin içeren DMEM ortamında, transfeksiyon için tohumlamadan önce hücreler %90 akıcıya ulaşana kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 karbondioksit ve %21 oksijen atmosferi ile kültürleyerek başlayın.
100 milimetrelik bir doku kültürü plakasında 10 mililitre tam büyüme ortamında altı hücreye dört kez 10 kez tohumlayın ve% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen atmosferine sahip nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca büyür. Her transfeksiyon için, metin makalesinde açıklandığı gibi giriş ve ambalaj plazmidlerinin oranını takip ederek, 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerinde bir mililitre serumsuz DMEM ortamında mililitre plazmid DNA stokları başına bir miligram seyreltin. Tüpü 10 saniye boyunca vorteks yapın ve toplamak için oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 10.000 kez G'de döndürün.
Daha sonra, tüpe mililitre başına bir miligramlık 70 mikrolitre polimer polietilenamin veya PEI stok çözeltisi ekleyin. Yine, vorteks ve kısaca tüpü döndürün. Lipofektamin bazlı transeksiyon için, vektörleri, kit içinde verilen 45 mikrolitre reaktif P içeren 500 mikrolitre serumsuz DMEM ortamında seyreltin.
Daha sonra, aynı ortamın 500 mikrolitresini kullanarak 70 mikrolitre reaktif L'yi seyreltin. Her iki tüpü de oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, her iki tüpün içeriğini birleştirin ve karmaşık formasyona izin vermek için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Daha sonra, hücreleri içeren plakaya damla damla bir mililitre DNA PEI veya DNA lipofectamine kompleksleri ekleyin ve% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen atmosferi ile 37 santigrat derecede altı saat boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, ortamı 10 mililitre taze tam büyüme ortamı ile değiştirin ve plakayı inkübatöre geri koyun. İki günlük transfeksiyondan sonra, virüs içeren ortamı toplayın ve hücreleri 10 mililitre taze tam büyüme ortamı ile kaplayın.
Yine, üç günlük transfeksiyondan sonra, virüs içeren medyayı toplayın ve iki günlük zaman noktasında toplanan medyayla birleştirin. Viral süpernatantı 2.000 kez G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca hücresel kalıntıları pelet etmek için santrifüj edin. Süpernatantı 0,45 mikron gözenek boyutunda düşük protein bağlayıcı bir filtre kullanarak filtreleyin ve ultrasantrifüjlemeye hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın.
Ultrasantrifüj tüplerinin tutma bardaklarını %70 etanol ile 10 dakika yıkayarak sterilize edin. Bardakları hava ile kurutun, kapatın ve dört santigrat dereceye yerleştirin. Steril bir ultrasantrifüj tüpüne lentiviral parçacıklar içeren filtrelenmiş ortama 36 mililitre ekleyin.
PBS'de hazırlanan dört mililitre steril% 20 sakkaroz çözeltisi ile steril bir striptizin beş mililitresini doldurun ve lentiviral vektörler veya LVS içeren tüpün dibine dağıtın. Sakkaroz çözeltisinin medya ile karıştırılmadığından ve tüpün dibinde bir gradyan oluşturduğundan emin olun. Serumsuz DMEM ortamını kullanarak tüm ultrasantrifüj tüplerini dengeleyin, tüpleri soğuk ultrasantrifüj tüp tutma kaplarına yerleştirin ve kapakları kapatın.
Tüpleri dört santigrat derecede iki saat boyunca 125.000 kez G'de döndürün. Spinden sonra, peleti rahatsız etmeden tüpün içeriğini çamaşır suyu içeren bir kapta ters çevirerek süpernatantı dikkatlice atın. Görünürse peleti işaretleyin.
Ultra santrifüj tüpünü 50 mililitrelik steril bir tüpe yerleştirin ve peletin üstüne 200 mikrolitre steril DPBS ekleyin. Tüpü gece boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Ertesi gün, herhangi bir döküntüyü pelet etmek için bir masa üstü santrifüjde 13.000 kez G'de dönmeden önce bir tüpün içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın.
Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve virüs preparatını aliquot. Son olarak, tüpleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Transfeksiyondan sonra, HEK293T hücrelerinde bol miktarda GFP ekspresyonu gözlendi.
Viral proteinlerin ekspresyonu, tek hücrelerin kaynaştığı HEK293T hücrelerinin sinsiti oluşumuna neden oldu. Enfeksiyonu takiben, viral enfekte nöral progenitör hücrelerde GFP'nin belirgin ekspresyonu da gözlendi. Düşük maliyetli PEI ve lipofectamine 3000 reaktifi arasındaki LVS titre ölçümü viral titrede anlamlı bir fark göstermedi.
PLK 0.1 tabanlı vektörler için viral titreler burada gösterilmiştir. Lentiviral transfekte hücreler, transdüktif olmayan hücrelere kıyasla% 80'den fazla hücre canlılığı gösterirken, hiçbir hücre tedaviden kurtulamadı. Batı leke analizi, boş bir vektör omurgası ile dönüştürülen hücrelerde L-2-hidroksiglutarat dehidrogenazın bol miktarda ekspresyonunu gösterdi.
Bununla birlikte, kısa saç tokası RNA'ları taşıyan bir vektörle dönüştürülen hücrelerde hiçbir ekspresyon gözlenmedi. Bu tekniğin temel avantajı, giriş ve paketleme vektörlerini kullanarak HEK293T hücrelerini birlikte transfekte ederek lentiviral parçacıklar üretmek için düşük maliyetli katyonik polimer polietilendiminin kullanılmasıdır.
