慢病毒介导的shRNA递送到hESC和NPC，使用低成本阳离子聚合物聚乙亚胺（PEI）

HEK293T细胞的转染必须在90%汇合度下进行。此外，使用0.45微米低蛋白结合过滤器进行慢病毒载体过滤和使用蔗糖垫进行超速离心也是必不可少的。首先在含有10%FBS和1X青霉素链霉素的DMEM培养基中，在37摄氏度的加湿培养箱中培养HEK293T细胞，在2%二氧化碳和21%氧气的气氛中，直到细胞达到90%汇合，然后接种进行转染。

在100毫米组织培养板中，在10毫升完全生长培养基中将10至6个细胞接种4次，并在具有5%二氧化碳和21%氧气气氛的加湿组织培养箱中生长过夜。对于每次转染，按照文本手稿中所述的进入和包装质粒的比例，在1.5毫升离心管中，在一毫升无血清DMEM培养基中稀释每毫升质粒DNA储备品一毫克。涡旋管10秒，并在室温下以10， 000次G旋转30秒以收集。

然后，向管中加入70微升每毫升聚合物聚乙烯亚胺或PEI储备溶液一毫克。再次，涡旋并短暂旋转管子。对于基于脂质番茄的转染，将载体稀释在500微升的无血清DMEM培养基中，该培养基含有试剂盒中提供的45微升试剂P。

然后，使用500微升的相同介质稀释70微升试剂L。将两个试管在室温下孵育五分钟。然后，将两个管的内容物合并并在室温下孵育20分钟以允许复杂的形成。

接下来，将一毫升DNA PEI或DNA脂质甲胺复合物滴加到含有细胞的板中，并在37摄氏度下在5%二氧化碳和21%氧气的气氛下孵育六小时。孵育后，用10毫升新鲜完全生长培养基替换培养基，并将板返回到培养箱中。转染两天后，收集含病毒培养基，并用10毫升新鲜完全生长培养基覆盖细胞。

同样，在转染三天后，收集含病毒的培养基，并将其与在两天时间点收集的培养基相结合。将病毒上清液以2， 000次G离心10分钟，在四摄氏度下沉淀细胞碎片。使用0.45微米孔径低蛋白结合过滤器过滤上清液，并在4摄氏度下储存，直到准备好进行超速离心。

用70%乙醇洗涤10分钟，对超速离心管的保温杯进行灭菌。风干，关闭，并将杯子置于四摄氏度。在含有慢病毒颗粒的过滤介质中加入36毫升到无菌超速离心管中。

用在PBS中制备的四毫升无菌20%蔗糖溶液填充五毫升无菌条带，并将其分配到含有慢病毒载体或LVS的管的底部。确保蔗糖溶液不应与培养基混合，并在管子底部产生梯度。使用无血清DMEM培养基平衡所有超速离心管，将试管置于保温杯的冷超速离心管中，然后合上盖子。

在4摄氏度下以125， 000次G旋转管两小时。旋转后，通过将管的内容物倒置在含有漂白剂的容器中而不干扰沉淀物来小心地丢弃上清液。标记颗粒（如果可见）。

将超速离心管置于50毫升无菌管中，并在沉淀顶部加入200微升无菌DPBS。将管子置于四摄氏度下过夜。第二天，通过上下移液轻轻混合管的内容物，然后在台式离心机中以13， 000倍G旋转以沉淀任何碎屑。

将上清液转移到新管中并等分试样病毒制剂。最后，将管子储存在零下80摄氏度。转染后，在HEK293T细胞中观察到丰富的GFP表达。

病毒蛋白的表达导致HEK293T细胞的合胞体形成，其中单个细胞融合。感染后，在病毒感染的神经祖细胞中也观察到GFP的显着表达。低成本PEI和脂质菲卡明3000试剂之间的LVS滴度测量在病毒滴度上没有显示出任何显着差异。

基于PLK 0.1的载体的病毒滴度如下所示。与非转导细胞相比，慢病毒转染细胞显示出超过80%的细胞活力，而没有细胞在治疗中存活下来。蛋白质印迹分析显示，L-2-羟基戊二酸脱氢酶在用空载体骨架转导的细胞中表达丰富。

然而，在用携带短发夹RNA的载体转导的细胞中没有观察到表达。该技术的主要优点是使用低成本的阳离子聚合物聚乙烯亚胺通过使用入口和包装载体共转染HEK293T细胞来产生慢病毒颗粒。