פרוטוקול זה מראה שיטת הגברה של מעגל מתגלגל לאיתור פעילות טופואיזומרז 1 בדגימות גולמיות בצורה מהירה ופשוטה. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם שקל לעקוב אחריה גם על ידי חוקרים לא מנוסים, והיא רגישה יותר בהשוואה למבחנים האחרים המבוססים על ג'ל כאשר נעשה שימוש בתמציות גולמיות. היישום של פרוטוקול זה משתרע ממדידת התגובה לטיפול תרופתי, להקרנה של תרכובות מולקולות קטנות עם השפעה פוטנציאלית אנטי סרטנית או אנטי זיהומית מחלות.
מי שידגים את ההליך יהיה מומחה הפיתוח קרול מיזילינסקי מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, חברו רשת בידוד סיליקון מעוצבת בהתאמה אישית לשקופית פונקציונלית, ובכך יצרו את יוצר הבאר. לחצו על רשת הסיליקון כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בין פני הזכוכית לסיליקון.
לאחר מכן, הכן את תערובת הפריימר על ידי הוספת חמישה מיקרומולר, חמישה פרימרים אמינו ראשוניים במאגר הדפסה חד פעמי. לאחר מכן מוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של תערובת זו לכל באר ומדגרים את יצרנית הבאר בתא הכלאה עם נתרן כלורי רווי. כדי ליצור סובסטרטים מעגליים סגורים, הוסף שני מיקרוליטרים של חמישה מיקרומולר טופואיזומרז 1 סובסטרט ספציפי ושני מיקרוליטרים של האנזים הרקומביננטי טופואיזומרז 1 או תמצית תאים מוכנה ל -16 מיקרוליטרים של מאגר תגובה טופואיזומראז חד פעמי.
לדגום תערובת מעגלית זו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולעצור את התגובה האנזימית על ידי הוספת שני microliters של 1% sds. לטבול את יצרנית הבאר במגש מלא בחיץ 1, שחומם מראש ב-50 מעלות צלזיוס. צננו את החיץ לתוך הבארות כדי להבטיח שלא יישארו בועות אוויר בתוך יצרנית הבאר, ולאחר מכן דגרו את המגש במשך 30 דקות בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, יש להסיר את החיץ 1 ולשטוף פעמיים במים מזוקקים עם ניעור נמרץ למשך דקה אחת בין השטיפות. הסר את המים, לאחר מכן, להוסיף חיץ 2, שחומם מראש ב 50 מעלות צלזיוס למגש, ולאחר מכן לדגור ולשטוף את יצרנית הבאר כפי שהוכח בעבר עבור חיץ 1. לאחר מכן, שטפו את יצרן הבאר ב-70% אתנול, עם ניעור נמרץ למשך דקה אחת והשתמשו באוויר דחוס כדי לאפשר להתקנה להתייבש.
כדי לבצע הכלאה, מוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של תערובת המעגלים המוכנים לכל באר מתאימה ומניחים את יצרנית הבאר בתא לחות עם מים מזוקקים ב 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. בתום הדגירה, שטפו את יצרן הבאר במשך דקה אחת כל אחד וחיץ 3, חיץ 4 ו-70% אתנול, ואז הניחו לו להתייבש באוויר. מכינים ומוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של תערובת RCA לכל באר של יצרנית הבאר, ודוגרים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים בתא הלחות.
כדי להמחיש באופן מיקרוסקופי את תוצרי העיגול הפלואורסצנטי המוגבר, ראשית, שטפו את המגלשה עם חיץ 3, חיץ 4 ו-70% אתנול. יבשו את המגלשה באוויר דחוס והדביקו אותה על מגלשת מיקרוסקופ. סמן את המיקום של הבארות עם סמן ולאחר מכן להסיר את רשת הסיליקון באמצעות פינצטה.
כדי לאפשר הדמיה במצלמה, הרכיבו את השקופית עם שני מיקרוליטרים של מדיום הרכבה ללא דאפי והוסיפו זכוכית כיסוי. נתח את השקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, עם עדשה אובייקטיבית לטבילת שמן פי 60 ומצלמה. לאחר ההדמיה, ייבא את התמונות לתמונה J וסדר את התמונות בערימה על-ידי לחיצה על תמונה, לאחר מכן על אוספים ותמונות לאוסף ולאחר מכן שנה את סוג התמונה ל- 8 סיביות.
כדי להגדיר את הסף, לחץ על תמונה, התאם ולאחר מכן סף. הגדר את הסרגל התחתון ל- 255 והתאם את הסרגל העליון כך שרק האותות הנכונים יהיו אדומים והרקע יהיה שחור. טאטאו את התמונות הבודדות וודאו שהן תואמות לתמונות לפני התאמת הסף.
ודא שהסף מוגדר נמוך ככל האפשר לפני שהאותות האמיתיים יתחילו להיעלם. כדי לספור את האותות, לחץ על נתח, ולאחר מכן על נתח חלקיקים וודא שהשדה המסוכם בהגדרות J בתמונה מסומן. הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של נוגדן אנטי-ביוטין מצומד של צנון סוס מדולל לכל באר ודגרה בטמפרטורה של 15 עד 25 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות בתא הלחות.
בסוף הדגירה, לשטוף את יצרנית הבאר שלוש פעמים עם חיץ 5 במשך שלוש דקות כל אחד ולתת לו להתייבש. כדי לדמיין את chemiluminescence, להוסיף שני microliters של ECL מוכן טרי luminol ותערובת מי חמצן לבארות ולדמיין את השקופית באמצעות מצלמת CCD או על סרטי רנטגן. לחלופין, כדי לדמיין עם TMB, הסר את רשת הסיליקון לאחר שטיפת מאגר 5 והוסף 400 מיקרוליטרים של TMB על גבי השקופית כולה.
שמור את השקופית בתא לחות והמתן חמש עד 10 דקות לפיתוח צבע. לאחר פיתוח צבע, לשטוף את השקופית עם 70% tethanol ולצלם את השקופית עם מצלמה או טלפון נייד לניתוח עם תוכנת תמונה J. ייבא את התמונה לתמונה J ושנה את סוג התמונה ל- 8 סיביות על ידי לחיצה על סוג תמונה ולאחר מכן 8 סיביות.
הגבל את השטח שנמדד באמצעות כלי ציור המלבן מסרגל הכלים כדי למדוד את הפסים בנפרד ולצייר את האזור הרצוי. מדוד את העוצמה על-ידי לחיצה, ניתוח ולאחר מכן מדידה. לאחר מכן, הזיזו את האזור שצויר במקור לרצועה הבאה ומדדו.
לאחר מדידת העוצמה של כל הלהקות, התווה את הנתונים בתוכנה הרצויה. פעילות טופואיזומרז 1 כפי שנקבעה על ידי קריאת סורק פלואורסצנטי מתוארת כאן, כפי שניתן לראות מהכימות. לקריאה זו יש מגבלת זיהוי של 12.5 ננוגרם, תמונות מייצגות והכימות המתקבל המתקבל באמצעות קריאת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מוצגים כאן.
לשיטת קריאה זו יש מגבלת זיהוי של 0.1 ננוגרם, סף הזיהוי של הכימילומינסנציה המשופרת ושיטות הקריאה הצבעוניות היה 6 ננוגרם. באמצעות אותן קריאות, מגבלת הזיהוי הייתה 1, 250 תאים עבור ECL ו-312 תאים עבור TMB. כאשר פעילות טופואיזומרז 1 נמדדה מתמציות של תאים שמקורם באדנוקרצינומה של המעי הגס.
כדוגמה ליישום בדיקת תרופות, פעילות הטופואיזומראז 1 נמדדה בנוכחות קמפטותצין או דימתיל סולפוקסיד. תוצאות הכימות הראו כי קמפטותצין מעכב טופואיזומראז 1 מעגליות מתווכת אחת של המצע כצפוי. זהו פרוטוקול פשוט שדורש רק תשומת לב ספציפית לשלבי הכביסה ולזמני הדגירה של התגובה.
ניתן גם לחקור כיצד תרופות מעכבות פעילות טופואיזומרז 1, השימוש בריד הוא רגיש מאוד וקל לביצוע, הוא מאפשר סריקה מהירה של מעכבי טופואיזומרז 1 פוטנציאליים, ושימוש בפעילות טופואיזומרז 1 כסמן ביולוגי לתגובת תרופות בסרטן.
