Этот протокол показывает метод усиления скользящего круга для быстрого и простого обнаружения активности топоизомеразы 1 в сырых образцах. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что ему легко следовать также неопытным исследователям, и он более чувствителен по сравнению с другими анализами на основе геля при использовании сырых экстрактов. Применение этого протокола простирается от измерения реакции на медикаментозное лечение до скрининга низкомолекулярных соединений с потенциальным противораковым или противоинфекционным эффектом.
Продемонстрировать процедуру будет специалист по разработке Кароля Мизелински из нашей лаборатории. Для начала прикрепите специально разработанную силиконовую изоляторную сетку к функционализированному слайду, тем самым сделав изготовителя скважины. Надавите на силиконовую сетку, чтобы избежать образования пузырьков воздуха между поверхностью стекла и силиконом.
Затем подготовьте грунтовочную смесь, добавив пять микромоляров, пять прайм-амино-праймеров в одноразовый буфер печати. Затем добавьте четыре микролитра этой смеси в каждую лунку и инкубируйте изготовителя скважины в камере гибридизации с насыщенным хлоридом натрия. Для получения замкнутых круглых субстратов добавляют два микролитра пяти микромолярных топоизомеразы 1 специфического субстрата и два микролитра рекомбинантного фермента топоизомеразы 1 или подготовленного клеточного экстракта к 16 микролитрам одноразового реакционного буфера топоизомеразы.
Инкубируйте эту круговую смесь при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут и остановите реакцию фермента, добавив два микролитра по 1% sds. Погрузите колодца в лоток, наполненный буфером 1, предварительно нагретым при 50 градусах Цельсия. Пипетка буфера в скважины, чтобы убедиться, что внутри колодца не осталось пузырьков воздуха, а затем инкубируйте лоток в течение 30 минут при 50 градусах Цельсия.
После инкубации снять буфер 1 и дважды промыть дистиллированной водой с энергичным встряхиванием в течение одной минуты между промывками. Удалите воду, затем добавьте буфер 2, предварительно нагретый при 50 градусах Цельсия в лоток, затем инкубируйте и промывайте колодец, как показано ранее для буфера 1. Затем промыть колодец 70% этанолом, с энергичным встряхиванием в течение одной минуты и использовать сжатый воздух, чтобы дать установке высохнуть.
Для выполнения гибридизации добавьте четыре микролитра подготовленной круговой смеси в каждую соответствующую скважину и поместите изготовителя скважины в камеру влажности с дистиллированной водой при 37 градусах Цельсия на один час. В конце инкубации промыть колодец по одной минуте каждый и буфер 3, буфер 4 и 70% этанола, затем дайте ему высохнуть на воздухе. Подготовьте и добавьте четыре микролитра смеси RCA в каждую лунку изготовителя скважины и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение двух часов в камере влажности.
Чтобы микроскопически визуализировать усиленные флуоресцентные продукты прокатного круга, сначала промыть слайд буфером 3, буфером 4 и 70% этанолом. Высушите слайд сжатым воздухом и приклейте его на предметное стекло микроскопа. отметьте маркером положение скважин, а затем снимите силиконовую сетку пинцетом.
Чтобы обеспечить визуализацию в камере, установите слайд с двумя микролитрами монтажной среды без dapi и добавьте защитное стекло. Проанализируйте слайд с помощью флуоресцентного микроскопа, с 60-кратным масляным погружным объективом и камерой. После создания изображения импортируйте изображения в изображение J и сложите изображения, щелкнув Изображение, затем Стеки и изображения в стек, затем измените тип изображения на 8 бит.
Чтобы установить пороговое значение, нажмите «Изображение», «Настроить», а затем «Порог». Установите нижнюю панель на 255 и отрегулируйте верхнюю панель так, чтобы только правильные сигналы были красными, а фон черным. Пролистайте отдельные изображения и убедитесь, что они соответствуют изображениям, прежде чем настраивать порог.
Убедитесь, что порог установлен как можно ниже, прежде чем реальные сигналы начнут исчезать. Чтобы подсчитать сигналы, нажмите «Анализировать», затем «Анализировать частицы» и убедитесь, что в настройках J изображения отмечено сводное поле. Добавьте четыре микролитра разбавленного пероксидазного антибиотинового антитела к хрену и инкубируйте при температуре от 15 до 25 градусов Цельсия в течение 50 минут в камере влажности.
В конце инкубации промыть колодец три раза буфером по 5 в течение трех минут каждый и дать ему высохнуть. Чтобы визуализировать хемилюминесценцию, добавьте два микролитра свежеприготовленной смеси люминола ECL и перекиси водорода в скважины и визуализируйте слайд с помощью ПЗС-камеры или на рентгеновских пленках. В качестве альтернативы, чтобы визуализировать с помощью TMB, снимите силиконовую сетку после буфера 5 промывки и добавьте 400 микролитров TMB поверх всего слайда.
Держите слайд в камере влажности и подождите от пяти до 10 минут для развития цвета. После развития цвета промыть слайд 70% этанолом и сфотографировать слайд с помощью камеры или мобильного телефона для анализа с помощью программного обеспечения image J. Импортируйте изображение в изображение J и измените тип изображения на 8 бит, щелкнув Тип изображения, а затем 8 бит.
Ограничьте измеряемую площадь с помощью инструмента «Прямоугольное рисование» с панели инструментов, чтобы измерить полосы отдельно и нарисовать нужную область. Измерьте интенсивность, щелкнув , Проанализировать, а затем Измерить. Затем переместите первоначально нарисованную область в следующую полосу и измерьте.
После измерения интенсивности для всех полос, постройте график данных в нужном программном обеспечении. Здесь изображена активность топоизомеразы 1, определяемая показаниями флуоресцентного сканера, как видно из количественной оценки. Это считывание имеет предел обнаружения 12,5 нанограммов, репрезентативные изображения и результирующая количественная оценка, полученная с использованием считывания флуоресцентного микроскопа, показаны здесь.
Этот метод считывания имеет предел обнаружения 0,1 нанограмма, порог обнаружения усиленной хемилюминесценции и методов считывания цвета o'metric составлял 6 нанограммов. Используя те же показания, предел обнаружения составлял 1 250 ячеек для ECL и 312 ячеек для TMB. При топоизомеразе 1 активность измеряли из экстрактов клеток колоректальной аденокарциномы.
В качестве примера применения скрининга лекарственного средства активность топоизомеразы 1 измеряли в присутствии камптотецина или диметилсульфоксида. Результаты количественной оценки показали, что камптотецин ингибирует топоизомеразу 1 одной опосредованной циркуляризации субстрата, как и ожидалось. Это простой протокол, который требует особого внимания только к этапам промывки и времени инкубации реакции.
Также можно исследовать, как препараты ингибируют активность топоизомеразы 1, используя Reid, является высокочувствительным и простым в выполнении, это позволяет быстро проводить скрининг потенциальных ингибиторов топоизомеразы 1 и использовать активность топоизомеразы 1 в качестве биомаркера для лекарственного ответа при раке.
