Este protocolo mostra um método de amplificação de círculo rolante para detectar a atividade da topoisomerase 1 em amostras brutas de forma rápida e simples. As principais vantagens deste método são que é fácil de seguir também por pesquisadores não experientes, e é mais sensível em comparação com os outros ensaios à base de gel quando extratos brutos são usados. A aplicação deste protocolo estende-se desde a medição da resposta ao tratamento medicamentoso, até ao rastreio de compostos de pequenas moléculas com potencial efeito anticancerígeno ou anti-doenças infecciosas.
Demonstrando o procedimento estará Karol Mizielinski especialista em desenvolvimento do nosso laboratório. Para começar, anexe uma grade de isolador de silicone personalizada a uma lâmina funcionalizada, tornando assim o fabricante do poço. Pressione a grade de silicone para evitar a formação de bolhas de ar entre a superfície do vidro e o silicone.
Em seguida, prepare a mistura de primer adicionando cinco micromolares, cinco primer amino prime em buffer de impressão de uma só vez. Em seguida, adicione quatro microlitros desta mistura a cada poço e incube o fabricante do poço em uma câmara de hibridização com cloreto de sódio saturado. Para gerar substratos circulares fechados, adicione dois microlitros de cinco substratos específicos da topoisomerase micromolar 1 e dois microlitros da enzima topoisomerase 1 recombinante ou um extrato celular preparado a 16 microlitros de tampão de reação topoisomerase único.
Incube esta mistura circular a 37 graus Celsius por 30 minutos e pare a reação enzimática adicionando dois microlitros de 1%sds. Mergulhe o fabricante do poço em uma bandeja cheia de tampão 1, pré-aquecida a 50 graus Celsius. Pipete o tampão para os poços para garantir que nenhuma bolha de ar permaneça dentro do fabricante do poço e, em seguida, incube a bandeja por 30 minutos a 50 graus Celsius.
Após a incubação, retire o tampão 1 e lave duas vezes com água destilada com agitação vigorosa durante um minuto entre as lavagens. Retire a água, em seguida, adicione o tampão 2, pré-aquecido a 50 graus Celsius à bandeja, em seguida, incube e lave o fabricante do poço, conforme demonstrado anteriormente para o tampão 1. Em seguida, lave o fabricante do poço com etanol a 70%, com agitação vigorosa por um minuto e use ar comprimido para permitir que a configuração seque.
Para realizar a hibridação, adicione quatro microlitros da mistura circular preparada a cada poço correspondente e coloque o fabricante do poço em uma câmara de umidade com água destilada a 37 graus Celsius por uma hora. No final da incubação, lave o bem por um minuto cada e tampão 3, tampão 4 e 70% etanol, em seguida, deixe secar ao ar. Prepare e adicione quatro microlitros da mistura RCA a cada poço do fabricante do poço e incube a 37 graus Celsius por duas horas na câmara de umidade.
Para visualizar microscopicamente os produtos do círculo rolante fluorescente amplificado, primeiro, lave a lâmina com tampão 3, tampão 4 e etanol a 70%. Seque a lâmina com ar comprimido e cole-a em uma lâmina de microscópio. marque a posição dos poços com um marcador e, em seguida, remova a grade de silicone usando uma pinça.
Para permitir a visualização na câmera, monte a lâmina com dois microlitros de meio de montagem sem dapi e adicione um vidro de cobertura. Analise a lâmina usando um microscópio de fluorescência, com uma lente objetiva de imersão em óleo de 60x e uma câmera. Após a geração de imagens, importe as imagens para a imagem J e empilhe as imagens clicando em Imagem, depois em Pilhas e Imagens para Pilha e, em seguida, altere o tipo de imagem para 8 bits.
Para definir o limite, clique em Imagem, Ajustar e, em seguida, em Limite. Defina a barra inferior para 255 e ajuste a barra superior para que apenas os sinais certos sejam vermelhos e o fundo seja preto. Varra as imagens individuais e certifique-se de que elas correspondem às imagens antes de ajustar o limite.
Certifique-se de que o limite seja definido o mais baixo possível antes que os sinais reais comecem a desaparecer. Para contar os sinais, clique em Analisar, seguido de Analisar partículas e verifique se o campo resumido nas configurações J da imagem está marcado. Adicione quatro microlitros de anticorpo antibiotina conjugado com peroxidase de rabanete de cavalo diluído a cada poço e incube a 15 a 25 graus Celsius por 50 minutos na câmara de umidade.
No final da incubação, lave o poço três vezes com tampão 5 por três minutos cada e deixe secar. Para visualizar a quimioluminescência, adicione dois microlitros de luminol ECL recém-preparado e mistura de peróxido de hidrogênio aos poços e visualize a lâmina usando uma câmera CCD ou em filmes de raios-x. Alternativamente, para visualizar com TMB, remova a grade de silicone após a lavagem do buffer 5 e adicione 400 microlitros de TMB em cima de toda a lâmina.
Mantenha o slide em uma câmara de umidade e aguarde de cinco a 10 minutos para o desenvolvimento da cor. Após um desenvolvimento de cores, lave o slide com etanol a 70% e fotografe o slide com uma câmera ou telefone celular para análise com software de imagem J. Importe a imagem para a imagem J e altere o tipo de imagem para 8 bits clicando em Tipo de Imagem e, em seguida, em 8 bits.
Limite a área medida usando a ferramenta de desenho de retângulo da barra de ferramentas para medir as bandas separadamente e desenhar a área desejada. Meça a intensidade clicando, Analisar e, em seguida, Mede. Em seguida, mova a área originalmente desenhada para a próxima faixa e meça.
Depois de medir a intensidade de todas as bandas, plote os dados no software desejado. A atividade da topoisomerase 1, determinada por uma leitura de scanner fluorescente, é representada aqui, como evidenciado a partir da quantificação. Esta leitura tem um limite de detecção de 12,5 nanogramas, imagens representativas e a quantificação resultante obtida usando a leitura do microscópio fluorescente, são mostradas aqui.
Este método de leitura tem um limite de detecção de 0,1 nanogramas, o limiar de detecção da quimioluminescência melhorada e os métodos de leitura ométrica colorida foram de 6 nanogramas. Usando as mesmas leituras, o limite de detecção foi de 1.250 células para a ECL e 312 células para TMB. Quando a atividade da topoisomerase 1 foi medida a partir de extratos de células derivadas do adenocarcinoma colorretal.
Como exemplo de aplicação de triagem medicamentosa, a atividade da topoisomerase 1 foi medida na presença de camptotecina ou dimetilsulfóxido. Os resultados da quantificação mostraram que a camptotecina inibe a topoisomerase 1 uma circularização mediada do substrato conforme esperado. Este é um protocolo simples que requer apenas atenção específica às etapas de lavagem e aos tempos de incubação da reação.
Também é possível investigar como as drogas inibem a atividade da topoisomerase 1, usando Reid é altamente sensível e fácil de executar, permite o rastreamento rápido de potenciais inibidores da topoisomerase 1 e o uso da atividade da topoisomerase 1 como um biomarcador para a resposta a medicamentos em cânceres.
