Questo protocollo mostra un metodo di amplificazione del cerchio rotante per rilevare l'attività della topoisomerasi 1 nei campioni grezzi in modo rapido e semplice. I principali vantaggi di questo metodo sono che è facile da seguire anche da ricercatori non esperti ed è più sensibile rispetto agli altri saggi a base di gel quando vengono utilizzati estratti grezzi. L'applicazione di questo protocollo si estende dalla misurazione della risposta al trattamento farmacologico, allo screening di composti a piccole molecole con potenziale effetto anti-cancro o anti-malattie infettive.
A dimostrare la procedura sarà Karol Mizielinski specialista dello sviluppo del nostro laboratorio. Per iniziare, collegare una griglia isolante in silicone progettata su misura a un vetrino funzionalizzato, rendendo così il produttore di pozzetti. Premere verso il basso sulla griglia in silicone per evitare la formazione di bolle d'aria tra la superficie del vetro e il silicone.
Quindi, preparare la miscela di primer aggiungendo cinque micromolari, cinque primer di ammino primi in un tampone di stampa una tantum. Quindi aggiungere quattro microlitri di questa miscela a ciascun pozzetto e incubare il produttore di pozzetti in una camera di ibridazione con cloruro di sodio saturo. Per generare substrati circolari chiusi, aggiungere due microlitri di cinque substrati specifici micromolari topoisomerasi 1 e due microlitri dell'enzima ricombinante topoisomerasi 1 o un estratto cellulare preparato a 16 microlitri di tampone di reazione topoisomerasi una tantum.
Incubare questa miscela circolare a 37 gradi Celsius per 30 minuti e interrompere la reazione enzimatica aggiungendo due microlitri di 1% sds. Immergere il produttore di pozzetti in un vassoio riempito con buffer 1, preriscaldato a 50 gradi Celsius. Pipettare il tampone nei pozzetti per assicurarsi che non rimangano bolle d'aria all'interno del produttore del pozzo, quindi incubare il vassoio per 30 minuti a 50 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone 1 e lavare due volte con acqua distillata agitando vigorosamente per un minuto tra un lavaggio e l'altro. Rimuovere l'acqua, quindi aggiungere il buffer 2, preriscaldato a 50 gradi Celsius al vassoio, quindi incubare e lavare il produttore di pozzetti come dimostrato in precedenza per il buffer 1. Quindi, lavare il produttore di pozzetti con etanolo al 70%, agitando vigorosamente per un minuto e utilizzare aria compressa per consentire all'installazione di asciugare.
Per eseguire l'ibridazione, aggiungere quattro microlitri della miscela circolare preparata a ciascun pozzetto corrispondente e posizionare il produttore di pozzetti in una camera di umidità con acqua distillata a 37 gradi Celsius per un'ora. Alla fine dell'incubazione, lavare il produttore di pozzetti per un minuto ciascuno e tamponare 3, tampone 4 e etanolo al 70%, quindi lasciarlo asciugare all'aria. Preparare e aggiungere quattro microlitri della miscela RCA a ciascun pozzetto del produttore di pozzi e incubare a 37 gradi Celsius per due ore nella camera di umidità.
Per visualizzare al microscopio i prodotti del cerchio di rotolamento fluorescente amplificato, in primo luogo, lavare il vetrino con tampone 3, tampone 4 e etanolo al 70%. Asciugare il vetrino con aria compressa e incollarlo su un vetrino da microscopio. Segnare la posizione dei pozzetti con un pennarello e quindi rimuovere la griglia di silicone usando una pinzetta.
Per consentire la visualizzazione nella fotocamera, montare la diapositiva con due microlitri di supporto di montaggio senza dapi e aggiungere un vetro di copertura. Analizza il vetrino usando un microscopio a fluorescenza, con un obiettivo ad immersione in olio 60x e una fotocamera. Dopo l'imaging, importa le immagini nell'immagine J e impila le immagini facendo clic su Immagine, quindi su Pile e Immagini su Impila, quindi modifica il tipo di immagine a 8 bit.
Per impostare la soglia, fare clic su Immagine, Regola e quindi su Soglia. Impostare la barra inferiore su 255 e regolare la barra superiore in modo che solo i segnali giusti siano rossi e lo sfondo sia nero. Scorri le singole immagini e assicurati che corrispondano alle immagini prima di regolare la soglia.
Assicurati che la soglia sia impostata il più in basso possibile prima che i segnali reali inizino a scomparire. Per contare i segnali, fare clic su Analizza, seguito da Analizza particelle e assicurarsi che il campo riepilogato nelle impostazioni J dell'immagine sia selezionato. Aggiungere quattro microlitri di anticorpo anti-biotina coniugato con ravanello cavallo diluito a ciascun pozzetto e incubare a 15-25 gradi Celsius per 50 minuti nella camera di umidità.
Alla fine dell'incubazione, lavare il produttore di pozzetti tre volte con tampone 5 per tre minuti ciascuno e lasciarlo asciugare. Per visualizzare la chemiluminescenza, aggiungere due microlitri di miscela di luminolo ECL e perossido di idrogeno appena preparata ai pozzetti e visualizzare il vetrino utilizzando una camera CCD o su pellicole a raggi X. In alternativa, per visualizzare con TMB, rimuovere la griglia in silicone dopo il lavaggio tampone 5 e aggiungere 400 microlitri di TMB sopra l'intero vetrino.
Tenere il vetrino in una camera di umidità e attendere da cinque a 10 minuti per lo sviluppo del colore. Dopo uno sviluppo del colore, lavare il vetrino con il 70% di metanolo e fotografare il vetrino con una fotocamera o un telefono cellulare per l'analisi con il software Image J. Importare l'immagine nell'immagine J e modificare il tipo di immagine a 8 bit facendo clic su Tipo di immagine e quindi su 8 bit.
Limitare l'area misurata utilizzando lo strumento di disegno rettangolo dalla barra degli strumenti per misurare separatamente le bande e disegnare l'area desiderata. Misurare l'intensità facendo clic, Analizza e quindi Misura. Quindi, spostate l'area originariamente disegnata sulla banda successiva e misurate.
Dopo aver misurato l'intensità per tutte le bande, tracciare i dati nel software desiderato. L'attività della topoisomerasi 1 determinata da una lettura dello scanner fluorescente è qui raffigurata, come evidente dalla quantificazione. Questa lettura ha un limite di rilevamento di 12,5 nanogrammi, immagini rappresentative e la quantificazione risultante ottenuta utilizzando la lettura del microscopio fluorescente, sono mostrate qui.
Questo metodo di lettura ha un limite di rilevamento di 0,1 nanogrammi, la soglia di rilevamento della chemiluminescenza potenziata e dei metodi di lettura ometrica a colori era di 6 nanogrammi. Utilizzando le stesse letture, il limite di rilevamento era di 1.250 cellule per l'ECL e 312 cellule per TMB. Quando l'attività della topoisomerasi 1 è stata misurata da estratti di cellule derivate dall'adenocarcinoma colorettale.
Come esempio di applicazione di screening farmacologico, l'attività della topoisomerasi 1 è stata misurata in presenza di camptotecina o dimetilsolfossido. I risultati della quantificazione hanno mostrato che la camptotecina inibisce la topoisomerasi 1 una circolarizzazione mediata del substrato come previsto. Si tratta di un protocollo semplice che richiede solo un'attenzione specifica alle fasi di lavaggio e ai tempi di incubazione della reazione.
È anche possibile studiare come i farmaci inibiscono l'attività della topoisomerasi 1, utilizzando Reid è altamente sensibile e facile da eseguire, consente uno screening rapido di potenziali inibitori della topoisomerasi 1 e l'uso dell'attività della topoisomerasi 1 come biomarcatore per la risposta ai farmaci nei tumori.
