Dieses Protokoll zeigt eine Rolling-Circle-Amplifikationsmethode, um die Topoisomerase-1-Aktivität in Rohproben schnell und einfach nachzuweisen. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie auch von unerfahrenen Forschern leicht zu befolgen ist und im Vergleich zu den anderen gelbasierten Assays empfindlicher ist, wenn Rohextrakte verwendet werden. Die Anwendung dieses Protokolls erstreckt sich von der Messung des Ansprechens auf die medikamentöse Behandlung bis hin zum Screening von niedermolekularen Verbindungen mit potenzieller Wirkung gegen Krebs oder antiinfektiöse Krankheiten.
Das Verfahren demonstriert Karol Mizielinski Entwicklungsspezialist aus unserem Labor. Befestigen Sie zunächst ein speziell entwickeltes Silikonisolatorgitter an einem funktionalisierten Objektträger, wodurch der Brunnenmacher entsteht. Drücken Sie auf das Silikongitter, um die Bildung von Luftblasen zwischen der Glasoberfläche und dem Silikon zu vermeiden.
Als nächstes bereiten Sie die Primermischung vor, indem Sie fünf mikromolare, fünf primäre Aminoprimer in einem Druckpuffer hinzufügen. Dann fügen Sie vier Mikroliter dieser Mischung zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie den Wellmaker in einer Hybridisierungskammer mit gesättigtem Natriumchlorid. Um geschlossene kreisförmige Substrate zu erzeugen, fügen Sie zwei Mikroliter fünf mikromolare Topoisomerase 1-spezifisches Substrat und zwei Mikroliter des rekombinanten Topoisomerase-1-Enzyms oder einen vorbereiteten Zellextrakt zu 16 Mikrolitern einmaligem Topoisomerase-Reaktionspuffer hinzu.
Inkubieren Sie diese Kreismischung bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten und stoppen Sie die Enzymreaktion, indem Sie zwei Mikroliter 1% sds hinzufügen. Tauchen Sie den Brunnenmacher in ein mit Puffer 1 gefülltes Tablett, das auf 50 Grad Celsius vorgeheizt ist. Pipettieren Sie den Puffer in die Vertiefungen, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen im Bohrlochhersteller verbleiben, und inkubieren Sie dann das Tablett für 30 Minuten bei 50 Grad Celsius.
Nach der Inkubation den Puffer 1 entfernen und zweimal mit destilliertem Wasser unter kräftigem Schütteln für eine Minute zwischen den Wäschen waschen. Entfernen Sie das Wasser, fügen Sie als nächstes Puffer 2, der bei 50 Grad Celsius vorgeheizt ist, in die Schale, inkubieren und waschen Sie den Brunnenmacher, wie zuvor für Puffer 1 demonstriert. Als nächstes waschen Sie den Bohrlocher mit 70% Ethanol unter kräftigem Schütteln für eine Minute und verwenden Sie Druckluft, damit das Setup trocknen kann.
Um eine Hybridisierung durchzuführen, fügen Sie vier Mikroliter der vorbereiteten Kreismischung in jede entsprechende Vertiefung und stellen Sie den Bohrlochmacher für eine Stunde in eine Feuchtigkeitskammer mit destilliertem Wasser bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation waschen Sie den Bohrlochmacher jeweils eine Minute lang und puffern Sie 3, Puffer 4 und 70% Ethanol und lassen Sie ihn dann an der Luft trocknen. Bereiten Sie vier Mikroliter der RCA-Mischung vor und geben Sie sie in jede Vertiefung des Bohrlochherstellers und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in der Feuchtigkeitskammer.
Um die amplifizierten fluoreszierenden Rollkreisprodukte mikroskopisch sichtbar zu machen, waschen Sie den Objektträger zunächst mit Puffer 3, Puffer 4 und 70% Ethanol. Trocknen Sie den Objektträger mit Druckluft und kleben Sie ihn auf einen Objektträger. Markieren Sie die Position der Vertiefungen mit einem Marker und entfernen Sie dann das Silikongitter mit einer Pinzette.
Um die Visualisierung in der Kamera zu ermöglichen, montieren Sie das Dia mit zwei Mikrolitern Montagemedium ohne Dapi und fügen Sie ein Deckglas hinzu. Analysieren Sie den Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 60-fachen Ölimmersionsobjektiv und einer Kamera. Importieren Sie nach dem Imaging die Bilder in Bild J und stapeln Sie die Bilder, indem Sie auf Bild klicken, dann auf Stapel und Bilder zum Stapeln und ändern Sie dann den Bildtyp auf 8 Bit.
Um den Schwellenwert festzulegen, klicken Sie auf Bild, Anpassen und dann auf Schwellenwert. Stellen Sie den unteren Balken auf 255 und stellen Sie den oberen Balken so ein, dass nur die richtigen Signale rot und der Hintergrund schwarz ist. Streichen Sie durch die einzelnen Bilder und stellen Sie sicher, dass sie den Bildern entsprechen, bevor Sie den Schwellenwert anpassen.
Stellen Sie sicher, dass der Schwellenwert so niedrig wie möglich eingestellt ist, bevor die realen Signale verschwinden. Um die Signale zu zählen, klicken Sie auf Analysieren, gefolgt von Partikel analysieren und stellen Sie sicher, dass das zusammengefasste Feld in den Einstellungen des Bildes J aktiviert ist. Fügen Sie vier Mikroliter verdünnten Meerrettichperoxidase-konjugierten Antibiotin-Antikörper in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei 15 bis 25 Grad Celsius für 50 Minuten in der Feuchtigkeitskammer.
Am Ende der Inkubation den Brunnenmacher dreimal mit Puffer 5 für jeweils drei Minuten waschen und trocknen lassen. Um die Chemilumineszenz zu visualisieren, geben Sie zwei Mikroliter frisch zubereitetes ECL-Luminol- und Wasserstoffperoxid-Gemisch in die Vertiefungen und visualisieren den Objektträger mit einer CCD-Kamera oder auf Röntgenfilmen. Alternativ, um mit TMB zu visualisieren, entfernen Sie das Silikongitter nach dem Puffer 5 Waschen und fügen Sie 400 Mikroliter TMB auf den gesamten Objektträger hinzu.
Bewahren Sie den Objektträger in einer Feuchtigkeitskammer auf und warten Sie fünf bis 10 Minuten, bis sich die Farbe entwickelt hat. Nach einer Farbentwicklung waschen Sie das Dia mit 70% Methanol und fotografieren Sie das Dia mit einer Kamera oder einem Mobiltelefon zur Analyse mit der Image J-Software. Importieren Sie das Bild in Bild J und ändern Sie den Bildtyp auf 8 Bit, indem Sie auf Bildtyp und dann auf 8 Bit klicken.
Begrenzen Sie den gemessenen Bereich, indem Sie das Rechteckzeichnungswerkzeug aus der Symbolleiste verwenden, um die Bänder separat zu messen und den gewünschten Bereich zu zeichnen. Messen Sie die Intensität durch Klicken, Analysieren und dann Messen. Verschieben Sie als Nächstes den ursprünglich gezeichneten Bereich zum nächsten Band und messen Sie.
Nachdem Sie die Intensität für alle Bänder gemessen haben, zeichnen Sie die Daten in der gewünschten Software. Die Aktivität der Topoisomerase 1, wie sie durch eine Fluoreszenzscanner-Anzeige bestimmt wird, ist hier dargestellt, wie aus der Quantifizierung ersichtlich ist. Diese Anzeige hat eine Nachweisgrenze von 12,5 Nanogramm, repräsentative Bilder und die resultierende Quantifizierung, die mit der fluoreszierenden Mikroskopauslesung erhalten wurde, sind hier dargestellt.
Diese Auslesemethode hat eine Nachweisgrenze von 0,1 Nanogramm, die Nachweisschwelle der verstärkten Chemilumineszenz und die farbometrischen Auslesemethoden lagen bei 6 Nanogramm. Bei gleichen Messwerten lag die Nachweisgrenze bei 1.250 Zellen für die ECL und 312 Zellen für TMB. Bei Topoisomerase 1 wurde die Aktivität aus Extrakten von kolorektalen Adenokarzinom-abgeleiteten Zellen gemessen.
Als Beispiel für eine Drogenscreening-Anwendung wurde die Topoisomerase 1-Aktivität in Gegenwart von Camptothecin oder Dimethylsulfoxid gemessen. Die Quantifizierungsergebnisse zeigten, dass Camptothecin die Topoisomerase 1 vermittelte Zirkular des Substrats wie erwartet hemmt. Dies ist ein einfaches Protokoll, das nur besondere Aufmerksamkeit für die Waschschritte und die Reaktionsinkubationszeiten erfordert.
Es ist auch möglich zu untersuchen, wie Medikamente die Topoisomerase 1-Aktivität hemmen, die Verwendung von Reid ist hochempfindlich und einfach durchzuführen, ermöglicht ein schnelles Screening potenzieller Topoisomerase-1-Inhibitoren und die Verwendung der Topoisomerase-1-Aktivität als Biomarker für die Arzneimittelreaktion bei Krebs.
