Ce protocole montre une méthode d’amplification du cercle roulant pour détecter l’activité de la topoisomérase 1 dans des échantillons bruts d’une manière simple et rapide. Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est facile à suivre également par des chercheurs non expérimentés, et elle est plus sensible par rapport aux autres tests à base de gel lorsque des extraits bruts sont utilisés. L’application de ce protocole s’étend de la mesure de la réponse au traitement médicamenteux au criblage de composés à petites molécules ayant un effet potentiel anticancéreux ou anti-infectieux.
La démonstration de la procédure sera assurée par Karol Mizielinski, spécialiste du développement de notre laboratoire. Pour commencer, fixez une grille d’isolateur en silicone conçue sur mesure à une lame fonctionnalisée, ce qui en fait le fabricant de puits. Appuyez sur la grille de silicone pour éviter la formation de bulles d’air entre la surface du verre et le silicone.
Ensuite, préparez le mélange d’apprêt en ajoutant cinq micromolaires, cinq amorces aminés primaires dans un tampon d’impression unique. Ajoutez ensuite quatre microlitres de ce mélange à chaque puits et incuber le fabricant de puits dans une chambre d’hybridation avec du chlorure de sodium saturé. Pour générer des substrats circulaires fermés, ajoutez deux microlitres de cinq micromolaires topoisomérase 1 substrat spécifique et deux microlitres de l’enzyme topoisomérase recombinante 1 ou un extrait cellulaire préparé à 16 microlitres de tampon réactionnel topoisomérase unique.
Incuber ce mélange circulaire à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes et arrêter la réaction enzymatique en ajoutant deux microlitres de 1% sds. Plongez le fabricant de puits dans un plateau rempli de tampon 1, préchauffé à 50 degrés Celsius. Pipeter le tampon dans les puits pour vous assurer qu’il ne reste pas de bulles d’air à l’intérieur du fabricant de puits, puis incuber le plateau pendant 30 minutes à 50 degrés Celsius.
Après l’incubation, retirer le tampon 1 et laver deux fois à l’eau distillée en agitant vigoureusement pendant une minute entre les lavages. Retirez l’eau, puis ajoutez le tampon 2, préchauffé à 50 degrés Celsius dans le plateau, puis incuber et laver le fabricant de puits comme démontré précédemment pour le tampon 1. Ensuite, lavez le fabricant de puits avec de l’éthanol à 70%, en agitant vigoureusement pendant une minute et utilisez de l’air comprimé pour permettre à l’installation de sécher.
Pour effectuer l’hybridation, ajoutez quatre microlitres du mélange circulaire préparé à chaque puits correspondant et placez le fabricant de puits dans une chambre d’humidité avec de l’eau distillée à 37 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’incubation, laver le fabricant de puits pendant une minute chacun et tamponner 3, tampon 4 et 70% d’éthanol, puis laisser sécher à l’air. Préparez et ajoutez quatre microlitres du mélange RCA à chaque puits du fabricant de puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures dans la chambre d’humidité.
Pour visualiser au microscope les produits de cercle roulant fluorescent amplifiés, lavez d’abord la lame avec le tampon 3, le tampon 4 et l’éthanol à 70%. Séchez la lame avec de l’air comprimé et collez-la sur une lame de microscope. Marquez la position des puits avec un marqueur, puis retirez la grille en silicone à l’aide d’une pince à épiler.
Pour permettre la visualisation dans la caméra, montez la diapositive avec deux microlitres de support de montage sans dapi et ajoutez un verre de couverture. Analysez la lame à l’aide d’un microscope à fluorescence, avec un objectif d’immersion dans l’huile 60x et une caméra. Après l’imagerie, importez les images dans l’image J et empilez les images en cliquant sur Image, puis Piles et Images vers Pile, puis changez le type d’image en 8 bits.
Pour définir le seuil, cliquez sur Image, Ajuster, puis sur Seuil. Réglez la barre inférieure sur 255 et ajustez la barre supérieure de sorte que seuls les bons signaux soient rouges et que l’arrière-plan soit noir. Parcourez les images individuelles et assurez-vous qu’elles correspondent aux images avant d’ajuster le seuil.
Assurez-vous que le seuil est réglé aussi bas que possible avant que les signaux réels ne commencent à disparaître. Pour compter les signaux, cliquez sur Analyser, puis sur Analyser les particules et assurez-vous que le champ résumé dans les paramètres de l’image J est coché. Ajouter quatre microlitres d’anticorps anti-biotine conjugués à la peroxydase de raifort dilués à chaque puits et incuber à 15 à 25 degrés Celsius pendant 50 minutes dans la chambre d’humidité.
À la fin de l’incubation, lavez le fabricant de puits trois fois avec du tampon 5 pendant trois minutes chacun et laissez-le sécher. Pour visualiser la chimiluminescence, ajoutez deux microlitres de mélange de luminol et de peroxyde d’hydrogène ECL fraîchement préparé dans les puits et visualisez la diapositive à l’aide d’une caméra CCD ou sur des films radiographiques. Alternativement, pour visualiser avec TMB, retirez la grille en silicone après le lavage tampon 5 et ajoutez 400 microlitres de TMB sur toute la lame.
Gardez la lame dans une chambre d’humidité et attendez cinq à 10 minutes pour le développement de la couleur. Après un développement de couleur, lavez la lame avec 70% de téthanol et photographiez la lame avec un appareil photo ou un téléphone portable pour l’analyse avec le logiciel image J. Importez l’image dans l’image J et changez le type d’image en 8 bits en cliquant sur Type d’image, puis sur 8 bits.
Limitez la surface mesurée à l’aide de l’outil de dessin rectangulaire de la barre d’outils pour mesurer les bandes séparément et dessiner la zone souhaitée. Mesurez l’intensité en cliquant, Analyser, puis Mesurer. Ensuite, déplacez la zone dessinée à l’origine vers la bande suivante et mesurez.
Après avoir mesuré l’intensité pour toutes les bandes, tracez les données dans le logiciel souhaité. L’activité de la topoisomérase 1 déterminée par une lecture fluorescente du scanner est représentée ici, comme le montre la quantification. Cette lecture a une limite de détection de 12,5 nanogrammes, des images représentatives et la quantification résultante obtenue à l’aide de la lecture au microscope fluorescent sont présentées ici.
Cette méthode de lecture a une limite de détection de 0,1 nanogramme, le seuil de détection de la chimiluminescence améliorée et les méthodes de lecture couleur o’métrique était de 6 nanogrammes. En utilisant les mêmes lectures, la limite de détection était de 1 250 cellules pour la LMTEC et de 312 cellules pour la TMB. Lorsque l’activité de la topoisomérase 1 a été mesurée à partir d’extraits de cellules dérivées d’adénocarcinomes colorectaux.
À titre d’exemple d’application de dépistage de drogues, l’activité de la topoisomérase 1 a été mesurée en présence de camptothécine ou de diméthylsulfoxyde. Les résultats de quantification ont montré que la camptothécine inhibe la circularisation médiée par la topoisomérase 1 du substrat comme prévu. Il s’agit d’un protocole simple qui ne nécessite qu’une attention particulière aux étapes de lavage et aux temps d’incubation de la réaction.
Il est également possible d’étudier comment les médicaments inhibent l’activité de la topoisomérase 1, l’utilisation de Reid est très sensible et facile à réaliser, elle permet un dépistage rapide des inhibiteurs potentiels de la topoisomérase 1 et l’utilisation de l’activité de la topoisomérase 1 comme biomarqueur de la réponse aux médicaments dans les cancers.
