פרוטוקול זה מציג את SPH CRISPR Activation System כאסטרטגיה חלופית לווקטורים נגיפיים קונבנציונליים לביצוע בדיקות פונקציית רווח באדיפוציטים. הוא מאפשר ביטוי יתר של גנים אנדוגניים של אדיפוציט יחיד או מרובים בסביבה התאית המורכבת של רקמת השומן על ידי אספקת RNA מנחה יחיד מותאם אישית באמצעות וירוס הקשור באדנו. השלבים המאתגרים של פרוטוקול זה קשורים לשיבוט הרנ"א המנחה היחיד ולייצור והזרקה של נגיף הקשור באדנו לרקמת השומן.
כדי להתחיל, תכנן RNA מדריך יחיד או sgRNA להפעלת CRISPR באמצעות chopchop או כל כלי מתאים אחר. עצבו את ה-sgRNA המכוון לגן PRDM16 באמצעות הפרמטרים הבאים:Target as PRDM16 ב-Mus musculus באמצעות CRISPR/Cas9 ועבור כהפעלה. הוסף שלוחות ל- sgRNA כדי להתאים לאתר הגבלת Sac1 בדובדבן עמוד השדרה הווקטורי PAAVU6GRNACBHM.
כלול 5'AGCT 3'כאשר n מתאים לנוקלאוטידים. קבל רצף משלים הפוך של 3'sgRNA באמצעות הכלי שצוין. לאחר מכן, לחישול של אוליגונוקלאוטידים משלימים חד-גדיליים, הוסף מיקרוליטר אחד מכל אוליגונוקלאוטיד חד-גדילי 5'ו-3', מיקרוליטר אחד של חיץ ליגאז T4, 0.5 מיקרוליטר של פולינוקלאוטיד קינאז T4, ו-6.5 מיקרוליטר מים לקבלת נפח תגובה סופי של 10 מיקרוליטר.
אנל את האוליגונוקלאוטידים החד-גדיליים המשלימים באמצעות תרמוסייקלר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן קצב עלייה של חמש מעלות צלזיוס לדקה. לאחר מכן עבור קשירה של אוליגונוקלאוטידים sgRNA מחושלים להוסיף 25 ננוגרם של דובדבן פלסמיד PAAVU6GRNACBHM לשני מיקרוליטרים של אוליגונוקלאוטידים sgRNA מחושלים, מיקרוליטר אחד של אנזים Sac1, שני מיקרוליטרים של 10X T4 DNA ligase buffer, מיקרוליטר אחד של T4 DNA ligase ומים לנפח תגובה סופי של 10 מיקרוליטר. באמצעות thermocycler, לבצע קשירה על ידי דגירה של תערובת התגובה במשך 15 מחזורים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ו 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאחר מכן להחזיק בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, להפוך את התאים Escherichia coli DH10B מוכשר עם ארבעה מיקרוליטר של מוצר קשירה על ידי הלם חום ב 42 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות ומרחים על צלחת אגר המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. אשר מושבות שעברו טרנספורמציה על ידי תגובת שרשרת קולוני פולימראז או PCR באמצעות PCR Master Mix, בחר את המושבה וערבב אותה עם חמישה מיקרוליטרים של Master Mix, 0.1 מיקרוליטר של פריימר אוניברסלי, 0.1 מיקרוליטר של פריימר הפוך sgRNA וחמישה מיקרוליטר מים. הפעל את ה-PCR באמצעות דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ולאחר מכן 35 מחזורים של דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, חישול במשך 30 שניות ב-60 מעלות צלזיוס, הארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ושלב התארכות סופי ב-72 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
לאחר PCR, לפתור את ה- DNA באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose ב 0.5X TAE Buffer ב 90 וולט במשך 30 דקות. שלח דגימות חיוביות עבור ריצוף Sanger באמצעות פריימר אוניברסלי. לאחר מכן, לטהר את הפלסמיד משיבוט חיובי באמצעות ערכת טיהור פלסמיד בהתאם להוראות היצרן.
הניחו את העכבר המרדים במצב שכיבה וגלחו אזור קטן באגפים הקרוב למפרקי הירך עבור רקמת שומן לבנה מפשעתית או הזרקות IWAT עם מכונת גילוח. מוסיפים קרם depilatory במשך חמש דקות. יש להסיר שאריות קרם עם מים כדי למנוע כוויות בעור.
לחטא את העור באמצעות שלושה סבבים לסירוגין של החלת תמיסת יוד פובידון על העור עם גזה נקייה ו 70% אלכוהול. לאחר מכן, בצע חתך של סנטימטר עד שניים עם מספריים מעוקרים באזור הפרוקסימלי של המפרקים והחזק את העור פתוח באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את מחסן השומן. ניתן לחבר את ה-WAT לעור משני הצדדים, ולהאריך אותו מההתחלה, מהגב לכיוון האשכים.
בעזרת מלקחיים, משכו בעדינות את מחסן השומן כלפי מעלה דרך החתך כדי לוודא שההזרקה נמצאת במיקום ובעומק הנכונים. מלאו את מזרק המיקרוליטר ב-2.5 מיקרוליטר של הנגיף הקשור באדנו, או AAV המכיל את ה-sgRNA המכוון לגן PRDM16 האנדוגני. הכנס בזהירות את המחט בזווית של 30-45 מעלות לתוך IWAT.
חזור על הזריקה חמש פעמים למיקומים שונים של הרקמה כדי להדביק הומוגנית את כל כרית השומן IWAT. הניחו את העכבר על כרית החימום עד להכרה חוזרת. עקוב אחר בעל החיים כל 10 עד 15 דקות עד שהוא מתאושש לחלוטין.
לאחר שהחיה חוזרת להכרה התבוננו בפרופיל הקטר, שאמור להיות ליניארי וללא סימני מצוקה או כאב. ראה את תאי כלי הדם סטרומה או SVF נגזר אדיפו SPH עכבר IWAT לתוך צלחת 6-Well המכילה מדיום DMEM שלם במשך שעה עד שעתיים, לשאוף את המדיום, לשטוף את הבאר פעמיים באמצעות PBS, ולהחליף אותו עם מדיום טרי ושלם. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות עד שהתאים מגיעים למפגש של 70-80%.
ביום 0, יש לגרום להתמיינות על ידי טיפול בתאים עם מדיום האינדוקציה ולאחר יומיים להחליף את מדיום האינדוקציה במדיום התחזוקה. שוב לאחר יומיים, ביום הרביעי, החליפו את אמצעי התחזוקה באמצעי תחזוקה טרי למשך 2-3 ימים. שנה את אמצעי התחזוקה כל 48 שעות עד שהפרדיפוציטים מתמיינים באופן מלא לאדיפוציטים.
התבונן באדיפוציטים הבוגרים באמצעות מיקרוסקופ אור כאשר התאים המתמיינים נראים עמוסים בטיפות שומנים. לאחר גידול התאים על צלחת תרבית 6-Well עם התווך המלא עד שהתאים מגיעים למפגש של 70-80%, מערבבים 5.6*10^10 גנום נגיפי למיקרוליטר של sgRNA PRDM16 נושא AAV עם שני מיליליטר של ברומיד בינוני מלא והקסדימתרין. התמירו את התאים על ידי החלפת המדיום השלם והוספת המדיום השלם המכיל AAV.
לדגור על התאים המומרים במשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות ו-5% פחמן דו חמצני. לפצל ולראות את התאים כפי שמתואר עבור התפשטות תאים והתמיינות לאדיפוציטים בצבע בז '. תמונות האימונופלואורסנציה מ-IWAT של עכברי adipo SPH הדגימו את הביטוי של dCas9 הן בקבוצת הביקורת והן בקבוצת PRDM16.
ביטוי PRDM16 המושרה על ידי SPH גרם בבירור להצטברות נרחבת של אדיפוציטים רב-עיניים בצבע בז' לתוך IWAT. יתר על כן, PCR כמותי גילה ביטוי מוגבר של PRDM16 ותוכנית הגן התרמוגנית בקבוצת PRDM16 בהשוואה לקבוצת הביקורת. באופן דומה, ניתוח ביטוי גנים במבחנה אישר את הביטוי המוגבר של הגן האנדוגני PRDM16 והגנים התרמוגניים בקבוצת ביטוי היתר PRDM16 בהשוואה לקבוצת הביקורת.
ביטוי PRDM16 המושרה על ידי SPH הביא לצריכת חמצן בסיסית ומקסימלית גבוהה יותר מזו שבתאי הביקורת. חשוב לציין כי הנתונים הצביעו על נשימה בלתי מצומדת מוגברת בקבוצת PRDM16 בהשוואה לזו שבקבוצת הביקורת. מודל Adipo SPH מתאים לחקר גנים מרובים ואלמנטים רגולטוריים בתוך אדיפוציטים.
שיטה זו פותחת את האפשרות להבנה עמוקה יותר של ביולוגיה של שומן בז'.
