יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות מערכת RNA חד-מנחה משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-Adeno-Associated Virus

פרוטוקול זה מייצר עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ומערכת RNA חד-מנחה הקשורה לווירוסים הקשורים לאדנו. הוא כולל טכניקה כירורגית כדי לנהל בבטחה AAV לתוך השומן החום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה ליצור במהירות נוקאאוטים ספציפיים לרקמות ללא צורך לגדל עכברים באופן סלקטיבי.

הגישה להכנת נוקאאוט ספציפי לרקמות או הפלות יכולה להיות מותאמת לרקמות אחרות אם ההליך הכירורגי להזרקת AAV משתנה על בסיס איבר היעד. כדי להתחיל, לנהל את משכך כאבים תת עורית לעכבר UCP1 Cre Cas9 מורדם כדי למזער ולמנוע כאב ומצוקה לאחר הניתוח. לאחר מכן יש לגלח את הפרווה על האזור הבין-סקפולרי שלה באמצעות מכונת גילוח, ולעקר את אזור הניתוח עם לפחות שלושה סיבובים לסירוגין של פילינג על בסיס יוד או כלורהקסידין, ואחריו 70% אתנול.

באמצעות אזמל, לבצע חתך של שני סנטימטרים בעור מעל רקמת השומן החומה בין עצם השכמה כדי לחשוף את השומן interscapular. לאחר ביצוע חתך יחיד, לחתוך את רקמות השומן על הגבול בין האזור הדיסטלי של רקמות השומן והשרירים. לאחר מכן בעזרת המספריים הכירורגיים ביד הדומיננטית, מקלפים את רקמות השומן בצורה בוטה ואנכית כדי לחשוף את רקמת השומן החומה תוך צביטת רקמות השומן, כולל רקמת השומן החומה, ביד הלא דומיננטית.

השתמש בווריד של זולצר כציון דרך כדי לציין את המיקום המדויק של רקמת השומן החומה. לאחר מכן, עבור כל עכבר, הזריקו 20 מיקרוליטר של וירוס הקשור לאדנו או AAV באיטיות לכל אונה של שתי רקמות השומן החומות באמצעות מחט חדה, 32 מד, המחוברת למזרק המילטון 100 מיקרוליטר. יש לוודא שההזרקה המוצלחת מסומנת בכך שאין דליפות מהאתר המוזרק במהלך מתן ה-AAV.

לאחר הבטחת הומאוסטזיס, החזירו את רקמות השומן החשופות למקומן הרגיל כדי לתפור את קצה רקמות השומן והשריר באמצעות חוט מונופילמנט נספג 5-0. לבסוף, תפרו את העור הפתוח בחוטים קלועים לא צבועים 5-0 VICRYL מצופים. לא ניתן לזהות את מיקומה המדויק של רקמת השומן החום מבלי לחשוף אותה, אולם חשיפה עודפת פוגעת ברקמה.

הפגמים הפוטנציאליים שאולי הובילו להזרקות לא מוצלחות כללו הזרקת תמיסת AAV לאזור הלא נכון, חדירת מחט דרך הרקמה, ובלון רקמה עקב נפח מוגזם של תמיסת AAV. ההעברה המדויקת של RNA מנחה יחיד AAV לרקמת השומן החומה הייתה חיונית להצלחת הפרוטוקול. המפתח להצלחה בחשיפת רקמת השומן החומה הוא טכניקת מספריים כירורגית, כולל כיוון ועומק המספריים, ומיקום מזרק המילטון.

לטכניקה זו יש חיות נוקאאוט ספציפיות לרקמות המייצרות עומסים כדי להבין את הרגולטורים המולקולריים של מטבוליזם האנרגיה הקשור לשומן חום.