Questo protocollo genera topi knockout specifici per il grasso bruno utilizzando un sistema di RNA a guida singola Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e virus adeno-associato. Include una tecnica chirurgica per somministrare in modo sicuro AAV nel grasso bruno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può generare rapidamente knockout tessuto-specifici senza bisogno di allevare topi in modo selettivo.
L'approccio per effettuare knockout o knockdown tessuto-specifici può essere adattato ad altri tessuti se la procedura chirurgica per l'iniezione di AAV viene modificata in base all'organo bersaglio. Per iniziare, somministrare l'analgesico per via sottocutanea al topo UCP1 Cre Cas9 anestetizzato per ridurre al minimo e prevenire il dolore e l'angoscia postoperatori. Quindi radere la pelliccia sulla sua area interscapolare usando un rasoio e sterilizzare l'area chirurgica con almeno tre cicli alternati di uno scrub a base di iodio o clorexidina, seguito da etanolo al 70%.
Usando un bisturi, fai un'incisione di due centimetri nella pelle sopra il tessuto adiposo bruno tra le scapole per esporre il grasso interscapolare. Dopo aver praticato una singola incisione, tagliare i tessuti adiposi al confine tra la regione distale dei tessuti grassi e dei muscoli. Quindi, utilizzando le forbici chirurgiche nella mano dominante, staccare i tessuti grassi senza mezzi termini e verticalmente per esporre il tessuto adiposo bruno mentre pizzicare i tessuti adiposi, incluso il tessuto adiposo bruno, con la mano non dominante.
Utilizzare la vena di Sulzer come punto di riferimento per indicare la posizione precisa del tessuto adiposo bruno. Successivamente, per ogni topo, iniettare lentamente 20 microlitri di virus adeno-associato o AAV in ciascun lobo dei due tessuti adiposi bruni utilizzando un ago affilato di calibro 32 collegato a una siringa di Hamilton da 100 microlitri. Confermare la riuscita dell'iniezione indicata dall'assenza di perdite dal sito iniettato durante la somministrazione di AAV.
Dopo aver assicurato l'omeostasi, riposizionare i tessuti adiposi esposti nella loro posizione normale per suturare il bordo dei tessuti adiposi e del muscolo utilizzando un filo monofilamento assorbibile 5-0. Infine, suturare la pelle aperta con 5-0 rivestiti VICRYL fili intrecciati non tinti. La posizione precisa del tessuto adiposo bruno non può essere identificata senza esporlo, tuttavia, danni da esposizione eccessiva al tessuto.
I potenziali difetti che potrebbero aver portato a iniezioni infruttuose includevano l'iniezione della soluzione AAV nella regione errata, la penetrazione dell'ago attraverso il tessuto e il gonfiamento del tessuto a causa di un volume eccessivo della soluzione AAV. La consegna precisa dell'RNA guida singola AAV al tessuto adiposo bruno è stata fondamentale per il successo del protocollo. La chiave del successo durante l'esposizione del tessuto adiposo bruno è la tecnica chirurgica a forbice, compresa la direzione e la profondità delle forbici e la posizione della siringa di Hamilton.
Questa tecnica ha un carico che genera animali knockout tessuto-specifici per comprendere i regolatori molecolari del metabolismo energetico correlato al grasso bruno.
