このプロトコルは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルスシングルガイドRNAシステムを使用して、褐色脂肪特異的ノックアウトマウスを生成します。これには、AAVを褐色脂肪に安全に投与するための外科的技術が含まれています。この技術の主な利点は、マウスを選択的に繁殖させることなく、組織特異的ノックアウトを迅速に生成できることです。
組織特異的ノックアウトまたはノックダウンを行うアプローチは、AAVを注射するための外科的手順が標的臓器に基づいて変更される場合、他の組織に適合させることができる。まず、鎮痛剤を麻酔をかけたUCP1 Cre Cas9マウスに皮下投与して、術後の痛みや苦痛を最小限に抑え、予防します。次に、シェーバーを使用して肩甲骨間領域の毛皮を剃り、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブを少なくとも3回交互に使用し、続いて70%エタノールで手術領域を滅菌します。
メスを使用して、肩甲骨の間の茶色の脂肪組織の上の皮膚を2センチメートル切開し、肩甲骨間脂肪を露出させます。1回切開した後、脂肪組織の遠位領域と筋肉の境界にある脂肪組織を切断します。次に、利き手の手術用ハサミを使用して、脂肪組織を鈍く垂直に剥がし、茶色の脂肪組織を露出させ、茶色の脂肪組織を含む脂肪組織を利き手ではない手でつまみます。
スルザー静脈をランドマークとして使用して、正確な茶色の脂肪組織の位置を示します。次に、各マウスについて、100マイクロリットルのハミルトン注射器に接続された鋭い32ゲージの針を使用して、20マイクロリットルのアデノ随伴ウイルスまたはAAVを2つの褐色脂肪組織の各葉にゆっくりと注入します。AAV投与中に注入部位からの漏れがないことが示す注入が成功したことを確認します。
恒常性を確保した後、露出した脂肪組織を通常の位置に戻し、5-0吸収性モノフィラメント糸を使用して脂肪組織と筋肉の端を縫合します。最後に、5-0コーティングされたVICRYL未染色編組糸で開いた皮膚を縫合します。褐色脂肪組織の正確な位置は、それを露出させなければ特定できないが、組織への過度の曝露損傷である。
注射の失敗につながった可能性のある潜在的な欠陥には、AAV溶液を誤った領域に注入すること、組織を通る針の貫通、およびAAV溶液の過剰な量による組織の膨らみが含まれていました。褐色脂肪組織へのAAVシングルガイドRNAの正確な送達は、プロトコルの成功に不可欠でした。褐色脂肪組織を露出させながら成功するための鍵は、はさみの方向と深さ、およびハミルトンシリンジの位置を含む外科用はさみ技術です。
この技術は、褐色脂肪関連のエネルギー代謝の分子調節因子を理解するために、負荷を発生させる組織特異的ノックアウト動物を有する。
