Генерация мышей-нокаутов, специфичных для бурого жира, с использованием комбинированной системы однонаправленной РНК Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированной вирусной РНК

Этот протокол генерирует мышей с нокаутом, специфичных для коричневого жира, с использованием системы однонаправленной РНК Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированного вируса. Он включает в себя хирургическую технику для безопасного введения AAV в бурый жир. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может быстро генерировать тканеспецифические нокауты без необходимости селективного разведения мышей.

Подход к созданию тканоспецифического нокаута или нокдаунов может быть адаптирован к другим тканям, если хирургическая процедура инъекции AAV модифицируется в зависимости от органа-мишени. Для начала введите анальгетик подкожно анестезированной мыши UCP1 Cre Cas9, чтобы свести к минимуму и предотвратить послеоперационную боль и дистресс. Затем сбрейте мех в межлопаточной области с помощью бритвы и стерилизуйте операционную область не менее чем тремя чередующимися раундами скраба на основе йода или хлоргексидина, а затем 70% этанола.

С помощью скальпеля сделайте двухсантиметровый разрез на коже над бурой жировой тканью между лопатками, чтобы обнажить межлопаточный жир. Сделав один разрез, разрежьте жировые ткани на границе между дистальным отделом жировых тканей и мышцами. Затем, используя хирургические ножницы в доминирующей руке, отклейте жировые ткани тупо и вертикально, чтобы обнажить коричневую жировую ткань, одновременно зажимая жировые ткани, включая коричневую жировую ткань, недоминантной рукой.

Используйте вену Sulzer в качестве ориентира, чтобы указать точное расположение коричневой жировой ткани. Затем для каждой мыши медленно вводите 20 микролитров аденоассоциированного вируса или AAV в каждую долю двух коричневых жировых тканей с помощью острой иглы 32 калибра, соединенной со шприцем Гамильтона объемом 100 микролитров. Подтвердите успешную инъекцию, о чем свидетельствует отсутствие утечек из места инъекции во время введения AAV.

После обеспечения гомеостаза поместите открытые жировые ткани обратно в их нормальное положение, чтобы сшить край жировых тканей и мышц с помощью рассасывающейся монофиламентной нити 5-0. Наконец, зашите открытую кожу неокрашенными плетеными нитями VICRYL с покрытием 5-0. Точное местоположение бурой жировой ткани не может быть идентифицировано без ее обнажения, однако чрезмерное воздействие повреждает ткани.

Потенциальные недостатки, которые могли привести к неудачным инъекциям, включали введение раствора AAV в неправильную область, проникновение иглы через ткань и раздувание ткани из-за чрезмерного объема раствора AAV. Точная доставка однонаправляющей РНК AAV в бурую жировую ткань имела решающее значение для успеха протокола. Ключом к успеху при обнажении коричневой жировой ткани является техника хирургических ножниц, включая направление и глубину ножниц, а также расположение шприца Гамильтона.

Этот метод имеет ткано-специфических нокаутирующих животных, генерирующих нагрузку, чтобы понять молекулярные регуляторы энергетического обмена, связанного с бурым жиром.