이 프로토콜은 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스 단일 가이드 RNA 시스템을 사용하여 갈색 지방 특이적 녹아웃 마우스를 생성합니다. 여기에는 갈색 지방에 AAV를 안전하게 투여하는 수술 기술이 포함됩니다. 이 기술의 주요 장점은 마우스를 선택적으로 번식시킬 필요 없이 조직 특이적 녹아웃을 빠르게 생성할 수 있다는 것입니다.
조직 특이적 녹아웃 또는 녹다운을 만드는 접근 방식은 AAV 주입을 위한 수술 절차가 표적 기관에 따라 수정되는 경우 다른 조직에 적용할 수 있습니다. 먼저, 수술 후 통증과 고통을 최소화하고 예방하기 위해 마취된 UCP1 Cre Cas9 마우스에 진통제를 피하 투여합니다. 그런 다음 면도기를 사용하여 견갑간 부위의 털을 면도하고 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽을 최소 3회 번갈아 가며 수술 부위를 소독한 다음 70% 에탄올을 사용합니다.
메스를 사용하여 견갑골 사이의 갈색 지방 조직 위의 피부에 2cm 절개를하여 견갑간 지방을 노출시킵니다. 단일 절개를 한 후 지방 조직과 근육의 원위 영역 사이의 경계에서 지방 조직을 자릅니다. 그런 다음 주로 사용하는 손에 있는 수술용 가위를 사용하여 지방 조직을 무뚝뚝하고 수직으로 떼어내어 갈색 지방 조직을 노출시키고 갈색 지방 조직을 포함한 지방 조직을 비우세 손으로 꼬집습니다.
Sulzer의 정맥을 랜드마크로 사용하여 정확한 갈색 지방 조직 위치를 나타냅니다. 다음으로, 각 마우스에 대해 100 마이크로 리터 해밀턴 주사기에 연결된 날카로운 32 게이지 바늘을 사용하여 두 개의 갈색 지방 조직의 각 엽에 20 마이크로 리터의 아데노 관련 바이러스 또는 AAV를 천천히 주입합니다. AAV 투여 중 주입 부위에서 누출이 없음을 나타내는 성공적인 주입을 확인합니다.
항상성을 확보한 후 노출된 지방 조직을 정상 위치로 되돌려 5-0 흡수성 모노필라멘트 실을 사용하여 지방 조직과 근육의 가장자리를 봉합합니다. 마지막으로 5-0 코팅된 VICRYL 염색되지 않은 편조 실로 열린 피부를 봉합합니다. 갈색 지방 조직의 정확한 위치는 노출시키지 않고는 식별할 수 없지만 조직에 대한 과도한 노출 손상.
주사 실패로 이어질 수 있는 잠재적인 결함에는 AAV 용액을 잘못된 부위에 주입하는 것, 조직을 통한 바늘 침투, 과도한 양의 AAV 용액으로 인한 조직 풍선이 포함됩니다. 갈색 지방 조직에 AAV 단일 가이드 RNA를 정확하게 전달하는 것은 프로토콜의 성공에 결정적이었습니다. 갈색 지방 조직을 노출시키면서 성공의 열쇠는 가위의 방향과 깊이, 해밀턴 주사기의 위치를 포함한 수술용 가위 기술입니다.
이 기술은 갈색 지방 관련 에너지 대사의 분자 조절자를 이해하기 위해 부하를 발생시키는 조직 특이적 녹아웃 동물을 가지고 있습니다.
