Este protocolo genera ratones knockout específicos de grasa marrón utilizando un sistema de ARN de guía única Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociados. Incluye una técnica quirúrgica para administrar AAV de forma segura en la grasa marrón. La principal ventaja de esta técnica es que puede generar rápidamente knockouts específicos de tejido sin necesidad de criar ratones selectivamente.
El enfoque para hacer knockout o knockdowns específicos del tejido se puede adaptar a otros tejidos si el procedimiento quirúrgico para inyectar AAV se modifica en función del órgano diana. Para comenzar, administrar el analgésico por vía subcutánea al ratón UCP1 Cre Cas9 anestesiado para minimizar y prevenir el dolor postoperatorio y la angustia. Luego afeite el pelaje en su área interescapular con una afeitadora y esterilice el área quirúrgica con al menos tres rondas alternas de un exfoliante a base de yodo o clorhexidina, seguido de etanol al 70%.
Usando un bisturí, haga una incisión de dos centímetros en la piel por encima del tejido adiposo marrón entre las escápulas para exponer la grasa interescapular. Después de hacer una sola incisión, corte los tejidos grasos en el borde entre la región distal de los tejidos grasos y los músculos. Luego, usando las tijeras quirúrgicas en la mano dominante, retire los tejidos grasos sin rodeos y verticalmente para exponer el tejido adiposo marrón mientras pellizca los tejidos grasos, incluido el tejido adiposo marrón, con la mano no dominante.
Use la vena de Sulzer como punto de referencia para indicar la ubicación precisa del tejido adiposo marrón. A continuación, para cada ratón, inyecte 20 microlitros de virus adenoasociado o AAV lentamente en cada lóbulo de los dos tejidos adiposos marrones utilizando una aguja afilada de calibre 32 conectada a una jeringa Hamilton de 100 microlitros. Confirme que la inyección exitosa indica que no hay fugas del sitio inyectado durante la administración de AAV.
Después de asegurar la homeostasis, coloque los tejidos grasos expuestos de nuevo en su posición normal para suturar el borde de los tejidos grasos y el músculo con un hilo de monofilamento absorbible 5-0. Finalmente, suturar la piel abierta con hilos trenzados sin teñir VICRYL recubiertos 5-0. La ubicación precisa del tejido adiposo marrón no se puede identificar sin exponerlo, sin embargo, el exceso de exposición daña el tejido.
Los defectos potenciales que pueden haber llevado a inyecciones fallidas incluyeron inyectar la solución de AAV en la región incorrecta, penetración de la aguja a través del tejido y abombamiento del tejido debido a un volumen excesivo de la solución AAV. La administración precisa de ARN guía único AAV al tejido adiposo marrón fue crucial para el éxito del protocolo. La clave del éxito al exponer el tejido adiposo marrón es la técnica quirúrgica de tijera, incluida la dirección y la profundidad de las tijeras, y la ubicación de la jeringa Hamilton.
Esta técnica tiene una carga de generación de tejido específico para animales knockout para comprender los reguladores moleculares del metabolismo energético relacionado con la grasa marrón.
