שיטה זו מאפשרת יצירה קלה של פלסמידים של ביטויי RNA מנחים לניסויים בהנחיית CRISPR. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי שיבוט יכול להתבצע בשלב אחד מדריך מזווג RNAs ניתן ליצור באמצעות פלסמידים ביטוי RNA מדריך יחיד. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, לדלל את פריימרים lyophilized במאגר TE 1X לריכוז סופי של 100 micromolar.
Aliquot כמות שווה של פריימרים קדימה ואחרץ לתוך צינורות כובע רצועת PCR. וורטקס לערבב. לאחר מכן, לסובב את תערובות RNA RNA oligonucleotide ב 100 פעמים G במשך 15 שניות.
הדגירה את התגובה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות לפני הגדרת הקשירה. הוסף בין מיקרוגרם אחד לחמישה מיקרוגרם של וקטור ביטוי מדריך PSB700 שנבחר ל- BSNB1 באמצעות 0.5 מיקרוליטרים של BSNB1 לכל מיקרוגרם של וקטור אחד. מוסיפים מים מזוקקים עד שהנפח הכולל הוא 40 מיקרוליטרים ונוהגים את העיכול במשך שעה ב-55 מעלות צלזיוס.
הפעל את מוצרי העיכול על 1.5% ג'ל אגרוז נמס נמוך. חותכים את רצועת עמוד השדרה הווקטורית המתעכלת המתאימה לרסיס בגודל של כ-9 קילו-בבס. מעבירים את פרוסת הג'ל לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
באמצעות ערכת טיהור ג'ל מסחרית, יש לחלץ את הדנ"א מג'ל אגרוז בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן לדלל את ה-DNA לתוך 10-15 microliters של מאגר TE כדי לקבל אלוט מרוכז. כאשר מוכנים לבצע קשירה להוסיף 15 microliters של מים מזוקקים לבקבוקון.
הוסף 1 microliter של מדריך RNA בעבר annealed oligonucleotides, מיקרוליטר אחד של BSNB1 מתעכל PSB700 מדריך ביטוי וקטור ו 2 microliters של 10XT4 מאגר תגובת ליגס DNA. ואז לערבב את הפתרון הזה על ידי מערבולת. הוסף מיקרוליטר אחד של רצועות DNA ומערבולת שוב.
סובב את הפתרון ב 100 פעמים G במשך 15 שניות. הדגירה את התגובות בטמפרטורת החדר במהלך הלילה הקפדה לכלול תגובה שלילית לא להוסיף שליטה כי יש וקטור מתעכל BSNB1 לבד ללא מדריך annealed RNA אוליגוט להוסיף. כדי להתחיל, להסיר E.coli מאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס ולהפשיר אותו על קרח במשך 5 עד 10 דקות.
הוסף 0.5 microliters של תערובת התגובה מוכנה שמונה microliters של E.coli מוסמך. שומרים את התערובת על הקרח במשך 30 דקות. מחממים את התערובת ב-42 מעלות במשך 45 שניות.
ואז לתת לתערובת לנוח על קרח במשך שתי דקות. באמצעות שייקר סיבובי, לשחזר את התרבות 250 microliters של מדיה SOC באמצעות התנאים המפורטים כאן עבור NEB DH5a או אורוות NEB. לאחר מכן, צלחת 80 microliters של התרבות על צלחת מרק lysogeny עמידות לאנטיביוטיקה מתאימה.
דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עבור NEB DH5a או ב 30 מעלות צלזיוס עבור אורוות NEB. כדי להתחיל, השתמש בפרוטוקול PCR המיוחד Phusion GC כדי ליצור את הקטע הדרוש כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הפעל מוצר PCR זה בג'ל 1%agarose וודא כי רצועה אחת נראית בכ- 490 זוגות בסיסים.
באמצעות ערכת מיצוי ג'ל לחתוך ולחלץ מוצר PCR זה. ואז aliquot מוכן 1X מאסטר לערבב לתוך צינורות PCR. באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף מיקרוליטר אחד של מוצר PCR בריכוז של 40 femtomoles לכל מיקרוליטר.
במיקרוליטר אחד של וקטור PSB700 להוסיף ריכוז של 40 femtomoles לכל מיקרוליטר. כלול פקד הכנסה ללא שימוש במיקרוליטר מים אחד במקום במדריך RNA אוליגונוקלאוטידים. לעכל את הווקטור ואת ligate מוסיפה בתגובה אחת באמצעות פרוטוקול שער הזהב המתואר בפרוטוקול הטקסט.
לאחר התגובה הראשונית שער הזהב להוסיף 0.5 microliters נוספים של האנזים BSNB1 לכל תגובה. המשך את התגובה ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. כאשר תגובת שער הזהב הושלמה המשך לתהליך הטרנספורמציה E.coli שתואר קודם לכן.
במחקר זה, וקטורים ביטוי RNA מדריך יחיד נוצרים בהצלחה באמצעות שתי שיטות. בשיטה הראשונה, עמוד השדרה הווקטורי מתעכל מראש ומקוטט בסדרה של אוליגונוקלאוטידים קצרים. השיטה השנייה השתמשה בשכפול שער הזהב כדי לעכל ולזלול בו זמנית בתגובה אחת.
RNA מדריך מזווג המביעים וקטורים, כל מונע על ידי מקדם עצמאי משלו נוצרים בהצלחה על ידי שיבוט קטע PCR מותאם אישית. שיבוט מוצלח עבור אחת משיטות אלה יגרום המראה של מושבות יותר באופן משמעותי עבור טרנספורמציות עם DNA הכנס המתאים בהשוואה לוח בקרה לא הכנס. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור לא לכלול פקדי הוספה בשלב השכפול שלך.
בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו הנדסת אפיגנום ניתן לבצע על מנת לענות על שאלות כמו מה ההשפעות חתימות כרומטין יש על ביטוי גנים.
