אוסטאוקלסטים הם סוג תא רב-גרעיני המשמש בדרך כלל חוקרים בתחומים כגון חקר מחלות עצם, חקר סרטן, הנדסת רקמות ומחקר אנדופרוטזה. עם זאת, התמיינות אוסטאוקלסטים יכולה להיות מאתגרת, שכן יש צורך באיחוי של קודמנים. בנוסף, הבחנה בין אוסטאוקלסטים אנושיים לבין IPSCs דורשת שימוש במגוון גורמים ביולוגיים בזמן הנכון.
כשמדובר בתאים ראשוניים אנושיים. CD34+תאי דם חד-גרעיניים היקפיים הם כיום סוג התא הנפוץ ביותר להתמיינות לאוסטאוקלסטים. עם זאת, גישה זו מוגבלת על ידי ההטרוגניות בתוך אוכלוסיית CD34+ ויכולת ההתרחבות המוגבלת שלהם.
IPSCs אנושיים מהווים מקור חלופי לאוסטאוקלסטים. מכיוון שניתן להפיץ אותם ללא הגבלת זמן, הם מאפשרים הרחבה ושדרוג של ייצור אוסטאוקלסט. זה מאפשר הבחנה של מספר גדול של אוסטאוקלסטים, מה שמקל על מחקר אוסטאוקלסט.
כאן, הפוסט-דוקטורנט שלנו אלכסנדר בלומקה והדוקטורנטית ג'סיקה סיימון, מדגימים את ההבחנה בין אוסטאוקלסטים לבין IPSCs אנושיים. התחל להעביר IPSCs על ידי הסרת אזורים מובחנים או אזורים עם צברי IPSC מתים רבים מתחת לסטריאומיקרוסקופ באמצעות קצה פיפטה P-10 או P-20 או מגרד תאים. אזורים מובחנים ייראו צפופים יותר ובצבע לבן יותר.
שטפו את התאים המנותקים עם מדיום ישן, ולאחר מכן שטפו את התאים המנותקים שנותרו עם PBS פעמיים. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של חמש יחידות לכל מיליליטר dispase לכל באר לבאר. את שולי המושבות המתרוממות מהצלחת ניתן לראות תחת הסטריאומיקרוסקופ לאחר שלוש עד חמש דקות.
בזהירות להסיר את dispase ולהוסיף מיליליטר אחד של DMEM/F-12 עם HEPES 15 מילימולרי. השתמש בכלי העברת תאי גזע או מרים תאים חד פעמי כדי לחתוך את האגרגטים לגודל קטן. העבר את המדיה עם אגרגטים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר באמצעות פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר או P-1000 עם קצה רחב משעמם.
שטפו את הבאר עם DMEM/F-12 והעבירו את המדיה לצינור ה-15 מיליליטר. צנטריפוגה את צברי IPSC פרוסים ב 200 G במשך שלוש דקות. הסר את הסופרנאטנט עם פיפטה מזכוכית פסטר והוסף שני מיליליטר של מדיום ללא סרום IPSC אנושי כדי לעקור ולהשהות מחדש את ה- IPSCs באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר או P-1000 עם קצוות רחבים.
שאפו את שאריות תמצית קרום הבסיס מלוחות הבאר המצופים מראש, והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום ללא סרום IPSC אנושי לכל באר של צלחת שש הקידוחים. העבר IPSCs לתוך בארות חדשות של צלחת שש בארות כך שהנפח הסופי יהיה שני מיליליטר של מדיום ללא סרום IPSC אנושי לכל באר באמצעות P-1000 עם קצוות רחבים. בהתאם לקו IPSC, יש למטב את יחסי הפיצול.
כאן נעשה שימוש ביחס פיצול של 1:6. מערבלים את צלחת הבאר כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני הצלחת לאחר העברת האגרגטים. השראת גוף עוברית.
שאפו את המדיום הישן מתרבויות IPSC ושטפו את הבארות עם DPBS. מוסיפים חצי מיליליטר שחומם מראש לטמפרטורת החדר לכל באר של צלחת בת שש בארות ומערבלים את כלי התרבית כדי לצפות את כל משטח הבאר. לדגור על כלי התרבית ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד שמונה דקות.
הסר את כלי הדם מהאינקובטור, שאף את התמיסה והוסף תווך שלב ראשון לבארות המורכב מ- 50 ננוגרם למיליליטר חלבון מורפוגני עצם אנושית 4, 50 ננוגרם למיליליטר גורם גדילה אנדותל כלי דם אנושי 165, 20 ננוגרם למיליליטר גורם תאי גזע אנושיים, ומעכב ROCK 10 מיקרומולרי Y-27632. נתקו תאים בעדינות על ידי שטיפת הבאר עם מדיום שלב ראשון. משוך תאים לתוך צינור חרוט.
הוסף תווך שלב אחד חדש לבארות ונתק את כל התאים שנותרו באמצעות מגרד תאים. לאחר העברת כל התאים לצינור, צנטריפוגה ב 200 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להניע את התאים. שאפו והשעו מחדש את התאים בסך הכל שני מיליליטר בשלב אחד מאוזן מראש.
ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מכשיר ספירת תאים אוטומטי זרע 12, 500 תאים לכל באר בצלחת עגולה בעלת חיבור נמוך במיוחד 96 בארות ב -100 מיקרוליטר של מדיום שלב ראשון. תחת המיקרוסקופ, תאים יופיעו באופן מפוזר לאורך כל התמיסה. צנטריפוגה את לוחות 96 בארות במשך שלוש דקות ב 100 G לאחר צנטריפוגה, התאים צריכים להתחיל להידמות ספרואידים כאשר מסתכלים תחת המיקרוסקופ.
מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. שנה חצי מהמדיום ביום הראשון וביום השני עם מדיה בשלב הראשון. השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להשליך מדיום ישן לתוך צלחת פטרי.
לאחר השלכת המדיה מלוח 96 הקידוחים, בדוק אם יש EBs שאולי הוסרו בטעות. העבירו את ה-EBs שהוסרו בטעות בצלחת הפטרי בחזרה באמצעות התמיינות המטופויטית פיפטה P-1000. מילוי מראש של צלחת שש בארות עם שלושה מיליליטר של שלב שני בינוני, אליו שני מילימולרי ultraglutamine, 55-micromolar בטא-mercaptoethanol, 25 ננוגרם למיליליטר, אינטרלוקין-3 אנושי, ו 100 ננוגרם למיליליטר מושבת מקרופאגים אנושיים גורם מגרה מושבה.
באמצעות P-1000 וקצה רחב נושא, להעביר שמונה EBs לתוך כל באר של צלחת שש בארות. לאחר ההעברה, בדקו בעין מתחת למיקרוסקופ הסטריאו שיש שמונה EBs בכל באר. לאחר חמישה עד שבעה ימים, אוכלוסיית תאים צפה המורכבת מתאים המטופויטיים אמורה להיות גלויה.
תקופת ההתמיינות ההמטופויטית יכולה להיות מגוונת, החל משבעה ימים. הבחנה במשך 10 ימים הראתה אוכלוסייה hematopoietic המורכבת CD45 + CD14 + ו CD11b + תת-אוכלוסיות. לאחר חמישה ימי טיפול במדיום שלב שני, בצע שינוי מדיום על ידי הסרה זהירה של המדיום הישן וניפוקו לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר.
מיד להוסיף מיליליטר אחד של שלב חדש שני בינוני לבארות. על מנת להציל תאים המטופויטיים צפים שאולי כבר קיימים, סובבו את הצינור עם המדיום הישן ב 300 גרם במשך חמש דקות. הוסף תווך שלב שני חדש לצינור והשהה מחדש על מנת לנתק תאים שהיו עשויים להיות מועברים עם התווך הישן.
הוסף שני מיליליטר של מדיום שלב שני חדש עם תאים שמורים לכל באר, שהיה מלא בעבר במיליליטר אחד של מדיום שלב שני. ביום ה-10 של התמיינות המטופויטית, תאים המטופויטיים צפים נקצרים על ידי איסופם לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר וניתן להקפיא אותם בחזרה באמצעות 10% DMSO, 50% FBS ו-40% בינוניים, או להשתמש בהם באופן מיידי כדי להמשיך ולהתמיין תאים לאוסטאוקלסטים. התבגרות M-CSF והתמיינות אוסטאוקלסט.
תאי זרע ב 200, 000 תאים לסנטימטר בריבוע ולטפל במשך שלושה ימים עם אלפא MEM בתוספת 10% FBS ו 50 ננוגרם למיליליטר M-CSF. על מנת לבצע בדיקות פונקציונליות או הדמיה, נתק את התאים שהתבגרו MCSF על ידי שטיפה עם P-1000 עם קצה רחב משעמם. מעבירים תאים מנותקים עם מדיום ישן לתוך צינור ומסתובבים למטה ב 300 G במשך חמש דקות.
השהה מחדש והמיס את גלולת התא עם אלפא MEM טרי בתוספת 10% FBS, 50 ננוגרם למיליליטר M-CSF ו-80 ננוגרם לליגנד RANK מיליליטר. זרעו מחדש תאים ב 200, 000 תאים לסנטימטר בריבוע להתמיין במשך שבעה עד תשעה ימים. אוסטאוקלסטים מרובי גרעינים מופיעים בדרך כלל בסביבות היום החמישי עד השביעי.
תוצאות מייצגות. ניתן לנתח את הרכב אוכלוסיית התאים ההמטופויטיים שנוצרה באמצעות ציטומטריית זרימה. כאן, תאים hematopoietic להראות אוכלוסייה גדולה של CD45 + תאים מקדימים.
אוכלוסיות תאים המבטאות את הסמנים המונוציטים CD14 ו- CD11b מהוות בדרך כלל שליש מכלל האוכלוסייה בהשוואה לבקרות איזוטיפ. ניתן לראות תחת המיקרוסקופ אוסטאוקלסטים ממוינים סופניים שמקורם ב-IPSC כתאים מרובי גרעינים חיוביים ל-TRAP. מיקרוסקופ קונפוקלי מראה צביעת תאים עבור קתפסין K.בדיקות פונקציונליות כגון בדיקות ספיגת עצם או מינרלים מאפשרות כימות נוסף של פעילות אוסטאוקלסט.
כאן, בורות ספיגה נראים לעין לאחר הסרת אוסטאוקלסט בוגר עם 10% אקונומיקה לפני ההדמיה, בעוד שמבשרי אוסטאוקלסט M-CSF שטופלו ללא תוספת של ליגנד RANK אינם מראים בורות ספיגה. מסקנה. פרוטוקול זה מאפשר בידול חזק ואמין של אוסטאוקלסטים אנושיים ויכול לספק פתרון מדף למחלות עצם או מחלות הכרוכות בהסתיידות עודפת. אנו משתמשים באוסטאוקלסטים כדי להנדס אותם עוד יותר לתוך תאי ה-RANK שלנו המשתמשים בתחום איתות תוך-תאי שניתן להפעיל בשילוב עם גורם כימי לדימריזציה להפעלת אוסטאוקלסטים מבוקרת ובלתי תלויה באוסטאופרוטגרין.
