はじめに破骨細胞は、骨疾患研究、がん研究、組織工学、エンドプロテーゼ研究などの分野の研究者によって一般的に使用される多核細胞タイプです。それにもかかわらず、破骨細胞の分化は、前駆体の融合が必要なため、困難な場合があります。さらに、ヒト破骨細胞とIPSCの鑑別には、さまざまな生物学的要因を適切なタイミングで使用する必要があります。
ヒトの初代細胞に関して言えば。CD34+末梢血単核細胞は、破骨細胞への分化に現在最も広く使用されている細胞タイプです。しかし、このアプローチは、CD34+集団内の不均一性とそれらの限られた拡張性によって制限されます。
ヒトIPSCは破骨細胞の代替供給源である。無期限に増殖できるため、破骨細胞産生の拡張性とスケールアップが可能です。これにより、多数の破骨細胞の分化が可能になり、破骨細胞の研究が容易になります。
ここでは、ポスドクのAlexander Blumkeと博士課程の学生Jessica Simonが、破骨細胞とヒトIPSCの継代IPSCの分化を実証しています。P-10またはP-20ピペットチップまたは細胞スクレーパーを使用して、実体顕微鏡下で分化した領域または多くの死んだIPSC凝集体を含む領域を除去することにより、IPSCの継代を開始します。分化した領域は、より濃く、より白く表示されます。
剥離した細胞を古い培地で洗い流し、残った剥離した細胞をPBSで2回洗い流します。次に、ウェル1ウェル当たり1ミリリットル当たり5単位の1ミリリットルをウェルに添加する。コロニーの縁が皿から浮き上がる様子は、3〜5分後に実体顕微鏡で観察することができます。
ディスパーゼを慎重に除去し、1ミリリットルのDMEM/F-12と15ミリモルのHEPESを加えます。幹細胞継代ツールまたは使い捨ての細胞リフターを使用して、凝集体を小さなサイズに切断します。凝集体を含む培地を、5ミリリットルの血清ピペットまたはワイドボアチップのP-1000を使用して、15ミリリットルのコニカルチューブに移します。
ウェルをDMEM/F-12で洗い流し、培地を15ミリリットルのチューブに移します。スライスしたIPSC凝集体を200Gで3分間遠心分離します。パスツールガラスピペットで上清を除去し、2ミリリットルのヒトIPSC無血清培地を加えて、5ミリリットルの血清ピペットまたはワイドボアチップのP-1000を使用してIPSCを除去し、再懸濁します。
プレコートされたウェルプレートから残った基底膜抽出物を吸引し、6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルのヒトIPSC無血清培地を加えます。チップが広いP-1000を使用して、最終容量がウェルあたり2ミリリットルのヒトIPSC無血清培地になるように、IPSCを6ウェルプレートの新しいウェルに移します。IPSCラインによっては、分割比を最適化する必要があります。
ここでは、1:6の分割比を使用しました。ウェルプレートを旋回させて、凝集体が移送された後、細胞をプレート全体に均等に分散させます。胚様体誘導。
IPSC培養物から古い培地を吸引し、DPBSでウェルをすすぎます。室温に予熱した半ミリリットルを6ウェルプレートの各ウェルに加え、培養容器を旋回させてウェル表面全体をコーティングします。培養容器を37°Cで5〜8分間インキュベートします。
インキュベーターから容器を取り出し、溶液を吸引し、50ナノグラム/ミリリットルのヒト骨形態形成タンパク質4、50ナノグラム/ミリリットルのヒト血管内皮増殖因子165、20ナノグラム/ミリリットルのヒト幹細胞因子、および10マイクロモルのROCK阻害剤Y-27632からなるウェルにステージ1培地を添加する。ステージ1の培地でウェルをすすぎ、細胞を静かに剥離します。細胞を円錐形のチューブに引き込みます。
新しいステージ1培地をウェルに追加し、セルスクレーパーを使用して残りの細胞を分離します。すべての細胞をチューブに移した後、室温で200 Gで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。細胞を吸引し、合計2ミリリットルの平衡化済みステージ1培地に再懸濁します。
血球計算盤または自動細胞計数装置を使用して細胞をカウントします シード12、ステージ1培地の100マイクロリットル中の丸底超低付着性96ウェルプレートでウェルあたり500個の細胞。顕微鏡下では、細胞は溶液全体にびまん性に現れます。96ウェルプレートを100 Gで3分間遠心分離します。 遠心分離後、顕微鏡で見ると細胞はスフェロイドに似始めるはずです。
プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。1日目と2日目に培地の半分をステージ1の培地で交換します。マルチチャンネルピペットを使用して、古い培地をペトリ皿に廃棄します。
96ウェルプレートから培地を廃棄した後、誤って取り除いた可能性のあるEBがないか確認します。ペトリ皿で誤って除去したEBを、P-1000ピペット造血分化を使用して戻します。6ウェルプレートのウェルに、2ミリモルのウルトラグルタミン、55マイクロモルのベータメルカプトエタノール、25ナノグラム/ミリリットル、ヒトインターロイキン-3、および100ナノグラム/ミリリットルのヒトマクロファージコロニー刺激因子を添加した3ミリリットルのステージ2培地をプレフィルします。
P-1000 とワイドボアチップを使用して、8 つの EB を 6 ウェルプレートの各ウェルに移します。移送後、実体顕微鏡で各ウェルに8つのEBがあることを目視で確認します。5〜7日後、造血細胞からなる浮遊細胞集団が見えるようになります。
造血分化期間は、7日間から変化させることができる。10日間の分化は、大きなCD45+CD14+およびCD11b+亜集団からなる造血集団を示しました。ステージ2培地で5日間処理した後、古い培地を慎重に取り除き、50ミリリットルのコニカルチューブに分注することにより、培地交換を行います。
ただちに1ミリリットルの新しい第2段階培地をウェルに加えます。すでに存在する可能性のある浮遊造血細胞を保存するために、古い培地でチューブを300 Gで5分間スピンダウンします。新しいステージ2の培地をチューブに追加し、古い培地と一緒に移された可能性のある細胞を剥離するために再懸濁します。
以前に1ミリリットルのステージ2培地で満たされた各ウェルに、保存された細胞を含む2ミリリットルの新しいステージ2培地を追加します。造血分化の10日目に、浮遊造血細胞を50ミリリットルの円錐管に集めて採取し、10%DMSO、50%FBS、および40%培地を使用して凍結するか、すぐに細胞をさらに破骨細胞に分化させるために使用できます。M-CSFの成熟と破骨細胞の分化。
200、000細胞/センチメートルの正方形で細胞を播種し、10%FBSおよびミリリットルM-CSFあたり50ナノグラムを補ったアルファMEMで3日間処理します。機能アッセイやイメージングを行うには、ワイドボアチップのP-1000で洗浄してMCSF成熟細胞を剥離します。剥離した細胞を古い培地とともにチューブに移し、300 Gで5分間スピンダウンします。
10%FBS、50ナノグラム/ミリリットルのM-CSF、および80ナノグラム/ミリリットルのRANKリガンドを添加した新鮮なαMEMで細胞ペレットを再懸濁し、溶解します。200、000細胞/センチメートルの正方形で細胞を再播種し、7〜9日間分化します。多核破骨細胞は通常、5〜7日目頃に現れます。
代表的な結果。生成された造血細胞集団の組成は、フローサイトメトリーを用いて解析することができる。ここで、造血細胞はCD45+前駆細胞の大きな集団を示します。
単球マーカーCD14およびCD11bを発現する細胞集団は、アイソタイプコントロールと比較すると、通常、全集団の3分の1を占めます。末端分化型IPSC由来破骨細胞は、TRAP陽性多核細胞として顕微鏡下で観察することができます。共焦点顕微鏡検査では、カテプシンKを染色した細胞が示され、骨やミネラル吸収アッセイなどの機能アッセイにより、破骨細胞活性のさらなる定量が可能になります。
ここでは、イメージング前に10%漂白剤で成熟破骨細胞を除去した後、吸収ピットが見られますが、RANKリガンドを添加せずに処理したM-CSF成熟破骨細胞前駆体は吸収ピットを示しません。結論。このプロトコルは、ヒト破骨細胞の頑健で信頼性の高い分化を可能にし、骨疾患や過剰な石灰化を伴う疾患に既製のソリューションを提供する可能性があります。破骨細胞を使用して、二量体化の化学的誘導剤と組み合わせて活性化し、制御されたオステオプロテゲリン非依存的な破骨細胞の活性化を可能にする細胞内シグナル伝達ドメインを使用するRANK細胞にさらに操作します。
