Giriş.Osteoklastlar, kemik hastalığı araştırmaları, kanser araştırmaları, doku mühendisliği ve endoprotez araştırmaları gibi alanlarda araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılan çok çekirdekli bir hücre tipidir. Bununla birlikte, osteoklast farklılaşması zor olabilir, çünkü öncüllerin füzyonu gereklidir. Ek olarak, insan osteoklastlarının IPSC'lerden ayırt edilmesi, doğru zamanda çeşitli biyolojik faktörlerin kullanılmasını gerektirir.
İnsan birincil hücreleri söz konusu olduğunda. CD34+periferik kan mononükleer hücreleri, osteoklastlara farklılaşmada şu anda en yaygın kullanılan hücre tipidir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, CD34+ popülasyonu içindeki heterojenlik ve sınırlı genişletilebilirlikleri ile sınırlıdır.
İnsan IPSC'leri osteoklastlar için alternatif bir kaynak sunar. Süresiz olarak çoğaltılabildikleri için, osteoklast üretiminin genişletilebilirliğine ve ölçeklendirilmesine izin verirler. Bu, osteoklast araştırmasını kolaylaştıran çok sayıda osteoklastın farklılaşmasına izin verir.
Burada, doktora sonrası Alexander Blumke ve doktora öğrencimiz Jessica Simon, osteoklastların insan IPSC'lerinden farklılaşmasını gösteriyor. Bir P-10 veya P-20 pipet ucu veya bir hücre kazıyıcı kullanarak stereomikroskop altında birçok ölü IPSC agregası olan farklılaşmış bölgeleri veya bölgeleri çıkararak IPSC'leri geçirmeye başlayın. Farklılaşmış bölgeler daha yoğun ve daha beyaz renkte görünecektir.
Ayrılmış hücreleri eski ortamla yıkayın, ardından kalan ayrılmış hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, kuyuya kuyu başına mililitre dispas başına bir mililitre beş birim ekleyin. Çanak yerden kalkan kolonilerin kenarları üç ila beş dakika sonra stereomikroskop altında gözlemlenebilir.
Dispaseyi dikkatlice çıkarın ve 15 milimolar HEPES ile bir mililitre DMEM / F-12 ekleyin. Agregaları küçük boyutta kesmek için bir kök hücre pasaj aracı veya tek kullanımlık bir hücre kaldırıcı kullanın. Ortamı agregalarla birlikte beş mililitrelik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlu bir P-1000 kullanarak 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
İyiliği DMEM / F-12 ile durulayın ve ortamı 15 mililitrelik tüpe aktarın. Dilimlenmiş IPSC agregalarını 200 G'de üç dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir Pasteur cam pipetle çıkarın ve beş mililitrelik bir serolojik pipet veya geniş delikli uçlu P-1000 kullanarak IPSC'leri yerinden çıkarmak ve yeniden süspanse etmek için iki mililitre insan IPSC serumsuz ortam ekleyin.
Önceden kaplanmış kuyucuk plakalarından kalan bazal membran ekstraktını aspire edin ve altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna bir mililitre insan IPSC serumsuz ortam ekleyin. IPSC'leri altı oyuklu bir plakanın yeni kuyularına aktarın, böylece nihai hacim, geniş delikli uçlara sahip bir P-1000 kullanarak kuyu başına iki mililitre insan IPSC serumsuz ortam olur. IPSC hattına bağlı olarak, bölme oranlarının optimize edilmesi gerekir.
Burada 1:6 bölme oranı kullanılmıştır. Agregalar aktarıldıktan sonra hücreleri plaka boyunca eşit olarak dağıtmak için kuyu plakasını döndürün. Embriyoid vücut indüksiyonu.
Eski ortamı IPSC kültürlerinden aspire edin ve kuyucukları DPBS ile durulayın. Altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna oda sıcaklığına yarım mililitre önceden ısıtılmış ekleyin ve tüm kuyu yüzeyini kaplamak için kültür kabını döndürün. Kültür kabını 37 ° C'de beş ila sekiz dakika inkübe edin.
Kabı inkübatörden çıkarın, çözeltiyi aspire edin ve mililitre insan kemiği morfojenik protein 4 başına 50 nanogram, mililitre insan vasküler endotelyal büyüme faktörü 165 başına 50 nanogram, mililitre insan kök hücre faktörü başına 20 nanogram ve 10 mikromolar ROCK inhibitörü Y-27632'den oluşan kuyucuklara birinci aşama ortamı ekleyin. Kuyuyu birinci aşama ortamıyla durulayarak hücreleri nazikçe ayırın. Hücreleri konik bir tüpe çekin.
Kuyulara yeni aşama bir ortam ekleyin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak kalan hücreleri ayırın. Tüm hücreleri tüpe aktardıktan sonra, hücreleri peletlemek için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Hücreleri toplam iki mililitre önceden dengelenmiş birinci aşama ortamında aspire edin ve yeniden süspanse edin.
Bir hemositometre veya otomatik hücre sayma cihazı kullanarak hücreleri sayın Tohum 12, 500 mikrolitre birinci aşama ortamında yuvarlak tabanlı ultra düşük ekli 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 100 hücre. Mikroskop altında, hücreler çözelti boyunca dağınık olarak görünecektir. 96 oyuklu plakaları 100 G'de üç dakika santrifüjleyin Santrifüjlemeden sonra, hücreler mikroskop altında bakıldığında sferoidlere benzemeye başlamalıdır.
Plakayı 37 derece C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Birinci aşama medya ile birinci gün ve ikinci gün ortamın yarısını değiştirin. Eski ortamı bir Petri kabına atmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
Medyayı 96 oyuklu plakadan attıktan sonra, yanlışlıkla çıkarılmış olabilecek EB'leri kontrol edin. Petri kabında yanlışlıkla çıkarılan EB'leri bir P-1000 pipet Hematopoietik farklılaşması kullanarak geri aktarın. İki milimolar ultraglutamin, 55-mikromolar beta-merkaptoetanol, mililitre başına 25 nanogram, insan interlökin-3 ve mililitre başına 100 nanogram insan makrofaj kolonisi uyarıcı faktörün eklendiği üç mililitre ikinci aşama ortamı ile altı oyuklu bir plakanın kuyularını önceden doldurun.
Bir P-1000 ve geniş delikli uç kullanarak, altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna sekiz EB aktarın. Aktardıktan sonra, stereo mikroskop altında her kuyucukta sekiz EB olup olmadığını gözle kontrol edin. Beş ila yedi gün sonra, hematopoetik hücrelerden oluşan yüzen bir hücre popülasyonu görünür hale gelmelidir.
Hematopoetik farklılaşma süresi yedi günden başlayarak değişebilir. 10 gün boyunca farklılaşma, büyük CD45 + CD14 + ve CD11b + alt popülasyonlarından oluşan hematopoietik bir popülasyon gösterdi. İkinci aşama besiyeri ile beş günlük tedaviden sonra, eski besiyerini dikkatlice çıkararak ve 50 mililitrelik konik bir tüpe dağıtarak orta bir değişiklik yapın.
Hemen kuyucuklara bir mililitre yeni aşama iki ortam ekleyin. Halihazırda mevcut olabilecek yüzen hematopoietik hücreleri kurtarmak için, tüpü eski ortamla 300 G'de beş dakika boyunca döndürün. Tüpe yeni aşama ikinci ortam ekleyin ve eski ortamla aktarılmış olabilecek hücreleri ayırmak için yeniden süspanse edin.
Daha önce bir mililitre ikinci aşama ortamı ile doldurulmuş olan her bir oyuğa kaydedilmiş hücrelerle iki mililitre yeni aşama iki ortam ekleyin. Hematopoietik farklılaşmanın 10. gününde, yüzen hematopoietik hücreler 50 mililitrelik konik bir tüpe toplanarak toplanır ve% 10 DMSO,% 50 FBS ve% 40 ortam kullanılarak dondurulabilir veya hücreleri osteoklastlara daha da farklılaştırmak için hemen kullanılabilir. M-CSF maturasyonu ve osteoklast farklılaşması.
Santimetre kare başına 200.000 hücrede tohum hücreleri ve üç gün boyunca% 10 FBS ve mililitre M-CSF başına 50 nanogram ile desteklenmiş alfa MEM ile muamele edin. Fonksiyonel tahliller veya görüntüleme yapmak için, MCSF ile olgunlaşmış hücreleri, geniş delikli uçlu bir P-1000 ile yıkayarak ayırın. Eski besiyeri olan ayrılmış hücreleri bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 300 G'de döndürün.
Hücre peletini %10 FBS, mililitre M-CSF başına 50 nanogram ve mililitre RANK ligand başına 80 nanogram ile desteklenmiş taze alfa MEM ile yeniden süspanse edin ve çözün. Hücreleri santimetre kare başına 200.000 hücrede yeniden tohumlayın ve yedi ila dokuz gün boyunca farklılaştırın. Çok çekirdekli osteoklastlar tipik olarak beş ila yedinci gün civarında ortaya çıkar.
Temsili sonuçlar. Üretilen hematopoietik hücre popülasyonunun bileşimi, akış sitometrisi kullanılarak analiz edilebilir. Burada hematopoetik hücreler büyük bir CD45+öncü hücre popülasyonu gösterirler.
Monosit belirteçleri CD14 ve CD11b'yi eksprese eden hücre popülasyonları, izotip kontrollerine kıyasla genellikle tüm popülasyonun üçte birini oluşturur. Terminal olarak diferansiye IPSC'den türetilen osteoklast, mikroskop altında TRAP pozitif çok çekirdekli hücreler olarak görülebilir. Konfokal mikroskopi, katepsin K için hücre boyamayı gösterir.Kemik veya mineral absorpsiyon deneyleri gibi fonksiyonel deneyler, osteoklast aktivitesinin daha fazla ölçülmesine izin verir.
Burada, görüntülemeden önce olgun osteoklast% 10 ağartıcı ile çıkarıldıktan sonra rezorpsiyon çukurları görülebilirken, RANK ligand eklenmeden tedavi edilen M-CSF ile olgunlaşmış osteoklast öncüleri rezorpsiyon çukurları göstermez. Son. Bu protokol, insan osteoklastlarının sağlam ve güvenilir bir şekilde ayırt edilmesini sağlar ve kemik hastalıkları veya aşırı kalsifikasyon içeren hastalıklar için kullanıma hazır bir çözüm sağlayabilir. Kontrollü ve osteoprotegerinden bağımsız osteoklast aktivasyonu için kimyasal bir dimerizasyon indükleyicisi ile birlikte aktive edilebilen bir hücre içi sinyal alanı kullanan RANK hücrelerimize daha fazla mühendislik yapmak için osteoklastları kullanıyoruz.
