Остеокласты - это многоядерный тип клеток, обычно используемый исследователями в таких областях, как исследования заболеваний костей, исследования рака, тканевой инженерии и исследования эндопротезов. Тем не менее, дифференцировка остеокластов может быть сложной задачей, поскольку необходимо слияние предшественников. Кроме того, дифференциация остеокластов человека от МПСК требует использования различных биологических факторов в нужное время.
Когда речь идет о первичных клетках человека. CD34+ мононуклеарные клетки периферической крови в настоящее время являются наиболее широко используемым типом клеток для дифференцировки в остеокласты. Однако этот подход ограничен гетерогенностью CD34+популяции и их ограниченной расширяемостью.
МПСК человека представляют собой альтернативный источник остеокластов. Поскольку их можно размножать бесконечно, они обеспечивают расширяемость и масштабирование производства остеокластов. Это позволяет дифференцировать большое количество остеокластов, что облегчает исследование остеокластов.
В этой статье наш постдок Александр Блюмке и аспирант Джессика Саймон демонстрируют дифференциацию остеокластов от человеческих IPSC. Начните пассирование IPSC с удаления дифференцированных областей или областей с большим количеством мертвых агрегатов IPSC под стереомикроскопом с помощью наконечника пипетки P-10 или P-20 или клеточного скребка. Дифференцированные области будут казаться более плотными и белыми по цвету.
Вымойте отсоединенные клетки старой средой, затем дважды смойте оставшиеся отсоединенные клетки PBS. Далее добавьте в лунку один миллилитр из пяти единиц на миллилитр диспаса на лунку. Края колоний, отрывающихся от чашки, можно наблюдать под стереомикроскопом через три-пять минут.
Осторожно удалите диспазу и добавьте один миллилитр DMEM/F-12 с 15-миллимолярным HEPES. Используйте инструмент для пассирования стволовых клеток или одноразовый подъемник клеток, чтобы нарезать агрегаты небольшого размера. Переложите среду с агрегатами в коническую пробирку объемом 15 миллилитров с помощью серологической пипетки объемом пять миллилитров или P-1000 с широкопроходным наконечником.
Промойте лунку с помощью DMEM/F-12 и перелейте среду в 15-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте нарезанные агрегаты IPSC при 200 г в течение трех минут. Удалите надосадочную жидкость с помощью стеклянной пипетки Пастера и добавьте два миллилитра человеческой сывороточной среды IPSC, чтобы сместить и повторно суспендировать IPSC с помощью серологической пипетки объемом пять миллилитров или P-1000 с широкоствольными наконечниками.
Аспирируйте оставшийся экстракт базальной мембраны из предварительно покрытых луночных планшетов и добавьте по одному миллилитру человеческой сывороточной среды IPSC в каждую лунку шестилуночного планшета. Перенесите IPSC в новые лунки шестилуночной пластины так, чтобы окончательный объем составлял два миллилитра человеческой безсывороточной среды IPSC на лунку с помощью P-1000 с широкоствольными наконечниками. В зависимости от линейки IPSC необходимо оптимизировать коэффициенты разделения.
Здесь использовалось соотношение 1:6. Вкрутите луночную пластину, чтобы равномерно распределить ячейки по пластине после переноса заполнителей. Индукция эмбриоидного тельца.
Аспирируйте старую среду из культур IPSC и промойте лунки DPBS. Добавьте полмиллилитра предварительно подогретого до комнатной температуры вещества в каждую лунку шестилуночного планшета и перемешайте сосуд для культуры, чтобы покрыть всю поверхность лунки. Инкубируйте культуральный сосуд при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти-восьми минут.
Извлеките сосуд из инкубатора, аспирируйте раствор и добавьте в лунки среду первой стадии, состоящую из 50 нанограммов на миллилитр костного морфогенного белка человека 4, 50 нанограммов на миллилитр фактора роста эндотелия сосудов человека 165, 20 нанограммов на миллилитр фактора стволовых клеток человека и 10 микромолярного ингибитора ROCK Y-27632. Аккуратно отделите клетки, промыв лунку средством первой ступени. Вытяните ячейки в коническую трубку.
Добавьте новую среду первой ступени в лунки и отделите оставшиеся ячейки с помощью скребка. После переноса всех клеток в пробирку центрифугу при 200 G в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки. Аспирировать и ресуспендировать клетки в общей сложности в двух миллилитрах предварительно уравновешенной среды первой стадии.
Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматического устройства для подсчета клеток Высевают 12 500 клеток на лунку в круглодонную 96-луночную пластину со сверхнизким креплением в 100 микролитров среды первой стадии. Под микроскопом клетки будут появляться диффузно по всему раствору. Центрифугируйте 96-луночные планшеты в течение трех минут при 100 G После центрифугирования клетки должны начать напоминать сфероиды при рассмотрении под микроскопом.
Поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Замените половину носителя в первый и второй день с помощью носителя первого этапа. Используйте многоканальную пипетку, чтобы утилизировать старую среду в чашку Петри.
После утилизации среды с 96-луночного планшета проверьте, нет ли ЭБ, которые могли быть случайно удалены. Случайно удаленные БЭ в чашке Петри перенесите обратно с помощью пипетки-1000 Гемопоэтическая дифференцировка. Предварительно заполняют лунки шестилуночного планшета тремя миллилитрами среды второй стадии, к которой добавляют двухмиллимолярный ультраглутамин, 55-микромолярный бета-меркаптоэтанол, 25 нанограммов на миллилитр, интерлейкин человека-3 и 100 нанограммов на миллилитр колониестимулирующий фактор макрофагов человека.
Используя P-1000 и широкоствольный наконечник, переместите восемь EB в каждую лунку шестилуночной пластины. После переноса проверьте на глаз под стереомикроскопом, что в каждой лунке по восемь ЭБ. Через пять-семь дней должна стать видимой плавающая клеточная популяция, состоящая из гемопоэтических клеток.
Период гемопоэтической дифференцировки может быть разнообразным, начиная с семи дней. Дифференцировка в течение 10 дней показала гемопоэтическую популяцию, состоящую из больших субпопуляций CD45+CD14+ и CD11b+. После пяти дней обработки средой второй стадии выполните замену среды, осторожно удалив старую среду и дозировав ее в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.
Сразу же добавьте в лунки один миллилитр новой среды второй стадии. Чтобы сохранить любые плавающие гемопоэтические клетки, которые, возможно, уже присутствуют, вращайте пробирку со старой средой при 300 G в течение пяти минут. Добавьте в пробирку новую среду второй ступени и ресуспендируйте ее, чтобы отделить клетки, которые могли быть перенесены вместе со старой средой.
Добавьте по два миллилитра новой среды второй стадии с сохраненными клетками в каждую лунку, которая ранее была заполнена одним миллилитром среды второй стадии. На 10-й день гемопоэтической дифференцировки плавающие гемопоэтические клетки собирают путем сбора их в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и могут быть либо заморожены с использованием 10% ДМСО, 50% ФБС и 40% среды, либо немедленно использованы для дальнейшей дифференцировки клеток в остеокласты. Созревание М-КСФ и дифференцировка остеокластов.
Засейте клетки по 200 000 клеток на сантиметр в квадрате и обрабатывайте в течение трех дней альфа-МЭМ с добавлением 10% FBS и 50 нанограммов на миллилитр M-CSF. Для проведения функционального анализа или визуализации отделите созревшие MCSF клетки путем промывки P-1000 с широкоствольным наконечником. Отсоединившиеся ячейки со старой средой переложить в пробирку и отжимать при 300 G в течение пяти минут.
Ресуспендируйте и растворите клеточную гранулу свежим альфа-МЕМ с добавлением 10% FBS, 50 нанограммов на миллилитр M-CSF и 80 нанограммов на миллилитр лиганда RANK. Повторно высевают клетки по 200 000 клеток на квадратный сантиметр и дифференцируют в течение семи-девяти дней. Многоядерные остеокласты обычно появляются на пятый-седьмой день.
Репрезентативные результаты. Состав сформированной популяции гемопоэтических клеток можно проанализировать с помощью проточной цитометрии. Здесь гемопоэтические клетки демонстрируют большую популяцию CD45+клеток-предшественников.
Клеточные популяции, экспрессирующие моноцитарные маркеры CD14 и CD11b, обычно составляют треть всей популяции по сравнению с контрольной группой. Терминально дифференцированный остеокласт, полученный из IPSC, можно рассматривать под микроскопом как TRAP-позитивные многоядерные клетки. Конфокальная микроскопия показывает окрашивание клеток на катепсин К. Функциональные анализы, такие как анализ костной ткани или абсорбции минералов, позволяют провести дальнейшую количественную оценку активности остеокластов.
Здесь видны рассасывающие ямки после удаления зрелого остеокласта с 10%-ным отбеливателем перед визуализацией, в то время как предшественники остеокласта, созревшие на основе М-КСФ, обработанные без добавления лиганда RANK, не имеют резорбционных ямок. Заключение. Этот протокол обеспечивает устойчивую и надежную дифференциацию остеокластов человека и может стать готовым решением для заболеваний костей или заболеваний, связанных с избыточной кальцификацией. Мы используем остеокласты для их дальнейшей инженерии в наши клетки RANK, которые используют внутриклеточный сигнальный домен, который может быть активирован в сочетании с химическим индуктором димеризации для контролируемой и остеопротегерин-независимой активации остеокластов.
