Introducción.Los osteoclastos son un tipo de célula multinucleada comúnmente utilizada por investigadores en áreas como la investigación de enfermedades óseas, la investigación del cáncer, la ingeniería de tejidos y la investigación de endoprótesis. Sin embargo, la diferenciación de los osteoclastos puede ser un reto, ya que es necesaria la fusión de precursores. Además, la diferenciación de los osteoclastos humanos de los IPSC requiere el uso de una variedad de factores biológicos en el momento adecuado.
Cuando se trata de células primarias humanas. Las células mononucleares CD34+ de sangre periférica son actualmente el tipo de célula más utilizado para la diferenciación en osteoclastos. Sin embargo, este enfoque está limitado por la heterogeneidad dentro de la población CD34+ y su limitada capacidad de expansión.
Las IPSC humanas presentan una fuente alternativa de osteoclastos. Como se pueden propagar indefinidamente, permiten la capacidad de expansión y el aumento de la producción de osteoclastos. Esto permite la diferenciación de un gran número de osteoclastos, lo que facilita la investigación de osteoclastos.
Aquí, nuestro postdoctorado Alexander Blumke y la estudiante de doctorado Jessica Simon, demuestran la diferenciación de los osteoclastos de las IPSC humanas Passaging IPSC. Comience a pasar las IPSC eliminando las regiones diferenciadas o las regiones con muchos agregados muertos de IPSC bajo el microscopio estereoscópico utilizando una punta de pipeta P-10 o P-20 o un raspador de células. Las regiones diferenciadas aparecerán más densas y de color más blanco.
Lave las células desprendidas con un medio viejo, luego lave las células desprendidas restantes con PBS dos veces. A continuación, agregue un mililitro de cinco unidades por mililitro de dispasa por pocillo al pocillo. Los bordes de las colonias que se desprenden del plato se pueden observar bajo el microscopio estereoscópico después de tres a cinco minutos.
Retire con cuidado la dispasa y agregue un mililitro de DMEM/F-12 con HEPES de 15 milimolares. Use una herramienta de paso de células madre o un elevador de células desechable para cortar los agregados en un tamaño pequeño. Transfiera el medio con agregados a un tubo cónico de 15 mililitros utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros o una P-1000 con punta de diámetro ancho.
Enjuague el pocillo con DMEM/F-12 y transfiera los medios al tubo de 15 mililitros. Centrifugar los agregados IPSC cortados en rodajas a 200 G durante tres minutos. Retire el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur y agregue dos mililitros de medio humano libre de suero IPSC para desalojar y resuspender los IPSC utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros o P-1000 con puntas de ánima ancha.
Aspire el extracto de membrana basal sobrante de las placas de pocillos prerrecubiertas y agregue un mililitro de medio libre de suero IPSC humano a cada pocillo de la placa de seis pocillos. Transfiera las IPSC a nuevos pocillos de una placa de seis pocillos de modo que el volumen final sea de dos mililitros de medio humano libre de suero IPSC por pocillo utilizando un P-1000 con puntas de diámetro ancho. Dependiendo de la línea IPSC, es necesario optimizar las relaciones de división.
En este caso, se utilizó una relación de división de 1:6. Gire la placa de pocillos para distribuir las celdas uniformemente a través de la placa después de que se hayan transferido los agregados. Inducción de cuerpos embrioides.
Aspire el medio antiguo de los cultivos IPSC y enjuague los pocillos con DPBS. Agregue medio mililitro de precalentado a temperatura ambiente en cada pocillo de una placa de seis pocillos y agite el recipiente de cultivo para cubrir toda la superficie del pocillo. Incubar el recipiente de cultivo a 37 grados C durante cinco a ocho minutos.
Retire el vaso de la incubadora, aspire la solución y agregue el medio de la etapa uno a los pocillos que consisten en 50 nanogramos por mililitro de proteína morfogénica ósea humana 4, 50 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento endotelial vascular humano 165, 20 nanogramos por mililitro de factor de células madre humanas y 10 micromolares inhibidor de ROCK Y-27632. Separe suavemente las células enjuagando el pocillo con el medio de la primera etapa. Introduce las células en un tubo cónico.
Agregue un nuevo medio de la etapa uno a los pocillos y separe las células restantes con un raspador de celdas. Después de transferir todas las células al tubo, centrifugar a 200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente para granular las células. Aspirar y resuspender las células en un total de dos mililitros pre-balanceados en medio de la primera etapa.
Cuente las células con un hemocitómetro o un dispositivo automatizado de recuento de células Siembre 12.500 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y fijación ultrabaja en 100 microlitros de medio de la primera etapa. Bajo el microscopio, las células aparecerán de forma difusa por toda la solución. Centrifugar las placas de 96 pocillos durante tres minutos a 100 G Después de centrifugar, las células deben comenzar a parecerse a esferoides cuando se observan bajo el microscopio.
Coloque la placa en una incubadora a 37 grados C. Cambie la mitad del medio el primer día y el segundo día con el medio de la etapa uno. Utilice una pipeta multicanal para desechar el medio viejo en una placa de Petri.
Después de desechar los medios de la placa de 96 pocillos, verifique si hay EB que puedan haberse eliminado accidentalmente. Transfiera los EB eliminados accidentalmente en la placa de Petri utilizando una pipeta P-1000 Diferenciación hematopoyética. Pre-llenar pocillos de una placa de seis pocillos con tres mililitros de medio de etapa dos, a los que se agrega ultraglutamina de dos milimolares, beta-mercaptoetanol de 55 micromolares, 25 nanogramos por mililitro, interleucina-3 humana y 100 nanogramos por mililitro de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos.
Usando un P-1000 y una punta de diámetro ancho, transfiera ocho EB a cada pocillo de la placa de seis pocillos. Después de la transferencia, verifique a ojo bajo el microscopio estereoscópico que haya ocho EB en cada pocillo. Después de cinco a siete días, una población de células flotantes compuesta por células hematopoyéticas debería hacerse visible.
El período de diferenciación hematopoyética puede variar, comenzando con siete días. La diferenciación durante 10 días mostró una población hematopoyética compuesta por grandes subpoblaciones CD45+CD14+y CD11b+. Después de cinco días de tratamiento con el medio de la etapa dos, realice un cambio de medio retirando con cuidado el medio viejo y dispensándolo en un tubo cónico de 50 mililitros.
Agregue inmediatamente un mililitro de medio nuevo de etapa dos a los pozos. Para salvar las células hematopoyéticas flotantes que ya puedan estar presentes, gire por el tubo con el medio viejo a 300 G durante cinco minutos. Agregue un nuevo medio de la etapa dos al tubo y vuelva a suspender para separar las células que podrían haber sido transferidas con el medio anterior.
Agregue dos mililitros de medio nuevo de la etapa dos con células guardadas en cada pocillo, que previamente se llenó con un mililitro del medio de la etapa dos. En el día 10 de la diferenciación hematopoyética, las células hematopoyéticas flotantes se recolectan recogiéndolas en un tubo cónico de 50 mililitros y pueden congelarse utilizando 10% de DMSO, 50% de FBS y 40% de medio, o usarse inmediatamente para diferenciar aún más las células en osteoclastos. Maduración del M-CSF y diferenciación de osteoclastos.
Células de siembra a 200.000 células por centímetro cuadrado y tratar durante tres días con alfa MEM suplementado con 10% de FBS y 50 nanogramos por mililitro de M-CSF. Para realizar ensayos funcionales o imágenes, separe las células maduradas con MCSF lavándolas con un P-1000 con punta de ánima ancha. Transfiera las células desprendidas con medio viejo a un tubo y gire a 300 G durante cinco minutos.
Resuspenda y disuelva el gránulo celular con alfa MEM fresco suplementado con 10% de FBS, 50 nanogramos por mililitro de M-CSF y 80 nanogramos por mililitro de ligando RANK. Vuelva a sembrar las células a 200.000 células por centímetro cuadrado y diferencie durante siete a nueve días. Los osteoclastos multinucleados suelen aparecer entre el quinto y el séptimo día.
Resultados representativos. La composición de la población de células hematopoyéticas generadas se puede analizar mediante citometría de flujo. Aquí, las células hematopoyéticas muestran una gran población de células precursoras CD45+.
Las poblaciones celulares que expresan los marcadores de monocitos CD14 y CD11b suelen constituir un tercio de toda la población en comparación con los controles de isotipos. Los osteoclastos derivados de IPSC terminalmente diferenciados se pueden ver bajo el microscopio como células multinucleadas positivas para TRAP. La microscopía confocal muestra la tinción de células para catepsina K. Los ensayos funcionales, como los ensayos de absorción ósea o mineral, permiten una mayor cuantificación de la actividad de los osteoclastos.
En este caso, las fosas de reabsorción son visibles después de eliminar los osteoclastos maduros con lejía al 10% antes de la obtención de imágenes, mientras que los precursores de osteoclastos madurados con M-CSF tratados sin la adición del ligando RANK no muestran fosas de reabsorción. Conclusión. Este protocolo permite la diferenciación robusta y fiable de los osteoclastos humanos y podría proporcionar una solución lista para usar para las enfermedades óseas o las enfermedades que implican un exceso de calcificación. Utilizamos osteoclastos para diseñarlos aún más en nuestras células RANK que utilizan un dominio de señalización intracelular que puede activarse junto con un inductor químico de dimerización para una activación osteoclástica controlada e independiente de la osteoprotegerina.
