Introdução.Os osteoclastos são um tipo de célula multinucleada comumente usado por pesquisadores em áreas como pesquisa de doenças ósseas, pesquisa de câncer, engenharia de tecidos e pesquisa de endopróteses. No entanto, a diferenciação dos osteoclastos pode ser desafiadora, uma vez que a fusão de precursores é necessária. Além disso, a diferenciação de osteoclastos humanos de IPSCs requer o uso de uma variedade de fatores biológicos no momento certo.
Quando se trata de células primárias humanas. As células mononucleares CD34+ do sangue periférico são atualmente o tipo celular mais utilizado para a diferenciação em osteoclastos. No entanto, essa abordagem é limitada pela heterogeneidade dentro da população CD34+ e sua limitada capacidade de expansão.
Os IPSCs humanos são uma fonte alternativa para osteoclastos. Como podem ser propagados indefinidamente, permitem a expansibilidade e o aumento da produção de osteoclastos. Isso permite a diferenciação de um grande número de osteoclastos, o que facilita a pesquisa de osteoclastos.
Aqui, nosso pós-doc Alexander Blumke e a doutoranda Jessica Simon, demonstram a diferenciação dos osteoclastos dos IPSCs humanos que passam IPSCs. Comece a passar IPSCs removendo regiões diferenciadas ou regiões com muitos agregados IPSC mortos sob o estereomicroscópio usando uma ponta de pipeta P-10 ou P-20 ou um raspador de células. Regiões diferenciadas aparecerão de cor mais densa e branca.
Lave as células destacadas com meio velho e, em seguida, lave as células separadas restantes com PBS duas vezes. Em seguida, adicione um mililitro de cinco unidades por mililitro de dispase por poço ao poço. As bordas das colônias saindo da placa podem ser observadas sob o estereomicroscópio após três a cinco minutos.
Remova cuidadosamente o dispase e adicione um mililitro de DMEM/F-12 com HEPES de 15 milimolares. Use uma ferramenta de passagem de células-tronco ou um elevador de células descartáveis para cortar os agregados em tamanho pequeno. Transfira o meio com agregados para um tubo cônico de 15 mililitros usando uma pipeta sorológica de cinco mililitros ou uma P-1000 com ponta de furo largo.
Enxágue o poço com DMEM/F-12 e transfira o meio para o tubo de 15 mililitros. Centrifugar os agregados IPSC fatiados a 200 G por três minutos. Remova o sobrenadante com uma pipeta de vidro Pasteur e adicione dois mililitros de meio isento de IPSC humano para desalojar e ressuspender os IPSCs usando uma pipeta sorológica de cinco mililitros ou P-1000 com pontas largas.
Aspirar o extrato remanescente da membrana basal das placas de poço pré-revestidas e adicionar um mililitro de meio isento de IPSC humano a cada poço da placa de seis poços. Transfira IPSCs para novos poços de uma placa de seis poços de modo que o volume final seja de dois mililitros de meio humano livre de IPSC por poço usando uma P-1000 com pontas de furo largo. Dependendo da linha IPSC, as taxas de divisão precisam ser otimizadas.
Aqui, uma razão de divisão de 1:6 foi usada. Gire a placa do poço para distribuir as células uniformemente pela placa após a transferência dos agregados. Indução do corpo embrionário.
Aspirar o meio antigo das culturas IPSC e enxaguar os poços com DPBS. Adicione meio mililitro de pré-aquecido à temperatura ambiente em cada poço de uma placa de seis poços e gire o recipiente de cultura para revestir toda a superfície do poço. Incubar o vaso de cultura a 37 graus C por cinco a oito minutos.
Remova o vaso da incubadora, aspirar a solução e adicionar o meio estágio um aos poços que consistem em 50 nanogramas por mililitro de proteína morfogênica óssea humana 4, 50 nanogramas por mililitro de fator de crescimento endotelial vascular humano 165, 20 nanogramas por mililitro de fator de células-tronco humanas e 10 inibidores micromolares de ROCK Y-27632. Desapegue suavemente as células enxaguando o poço com o meio estágio um. Puxe as células para dentro de um tubo cônico.
Adicione um novo estágio um meio aos poços e desanexe as células restantes usando um raspador de células. Após transferir todas as células para o tubo, centrifugar a 200 G por cinco minutos à temperatura ambiente para peletizar as células. Aspirar e ressuspender as células em um total de dois mililitros pré-equilibrados estágio um meio.
Conte células usando um hemocitômetro ou dispositivo automatizado de contagem de células Seed 12, 500 células por poço em uma placa de 96 poços de ultrabaixo acesso de fundo redondo em 100 microlitros de meio estágio um. Sob o microscópio, as células aparecerão difusamente em toda a solução. Centrifugar as placas de 96 poços por três minutos a 100 G Após a centrifugação, as células devem começar a se assemelhar a esferoides quando vistas ao microscópio.
Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus C. Troque metade do meio no primeiro e no segundo dia com a mídia do estágio um. Use uma pipeta multicanal para descartar o meio velho em uma placa de Petri.
Depois de descartar os meios da placa de 96 poços, verifique se há EBs que podem ter sido removidos acidentalmente. Transfira os EBs removidos acidentalmente na placa de Petri de volta usando uma pipeta P-1000 Diferenciação hematopoiética. Poços de pré-enchimento de uma placa de seis poços com três mililitros de meio estágio dois, aos quais são adicionados ultraglutamina de dois milimolares, beta-mercaptoetanol 55-micromolares, 25 nanogramas por mililitro, interleucina-3 humana e 100 nanogramas por mililitro de fator estimulador de colônia de macrófagos humanos.
Usando uma P-1000 e uma ponta de furo largo, transfira oito EBs para cada poço da placa de seis poços. Após a transferência, verifique a olho nu sob o microscópio estéreo se oito EBs estão em cada poço. Após cinco a sete dias, uma população celular flutuante composta por células hematopoéticas deve tornar-se visível.
O período de diferenciação hematopoética pode ser variado, iniciando-se com sete dias. A diferenciação por 10 dias mostrou uma população hematopoiética composta por grandes subpopulações CD45+CD14+ e CD11b+. Após cinco dias de tratamento com o meio estágio dois, realizar uma troca de meio removendo cuidadosamente o meio antigo e dispensando-o em um tubo cônico de 50 mililitros.
Adicione imediatamente um mililitro de novo estágio dois médio aos poços. Para salvar as células hematopoiéticas flutuantes que já possam estar presentes, gire o tubo com o meio antigo a 300 G por cinco minutos. Adicione novo meio estágio dois ao tubo e ressuspenda para destacar as células que poderiam ter sido transferidas com o meio antigo.
Adicione dois mililitros de novo meio estágio dois com células salvas em cada poço, que foi previamente preenchido com um mililitro de meio estágio dois. No 10º dia da diferenciação hematopoiética, as células hematopoéticas flutuantes são colhidas coletando-as em um tubo cônico de 50 mililitros e podem ser congeladas de volta usando DMSO 10%, FBS 50% e meio 40%, ou imediatamente usadas para diferenciar ainda mais as células em osteoclastos. Maturação do M-LCR e diferenciação osteoclástica.
Células de sementes a 200.000 células por centímetro quadrado e tratar por três dias com alfa MEM suplementado com 10% FBS e 50 nanogramas por mililitro M-CSF. Para realizar ensaios funcionais ou de imagem, desprenda as células maturadas com MCSF lavando com uma P-1000 com ponta de furo largo. Transfira as células destacadas com o meio velho para um tubo e gire para baixo a 300 G por cinco minutos.
Ressuspenda e dissolva o pellet celular com MEM alfa fresco suplementado com 10% FBS, 50 nanogramas por mililitro M-CSF e 80 nanogramas por mililitro ligante RANK. Resemear células a 200.000 células por centímetro ao quadrado e diferenciar por sete a nove dias. Os osteoclastos multinucleados geralmente aparecem por volta do quinto ao sétimo dia.
Resultados representativos. A composição da população de células hematopoéticas geradas pode ser analisada por citometria de fluxo. Aqui, as células hematopoéticas apresentam uma grande população de células precursoras CD45+.
As populações celulares que expressam os marcadores de monócitos CD14 e CD11b geralmente constituem um terço de toda a população quando comparadas aos controles isotípicos. Osteoclastos derivados de IPSC terminalmente diferenciados podem ser vistos ao microscópio como células multinucleadas positivas para TRAP. A microscopia confocal mostra a coloração de células para catepsina K. Ensaios funcionais, como ensaios de absorção óssea ou mineral, permitem quantificar mais a atividade osteoclástica.
Aqui, os orifícios de reabsorção são visíveis após a remoção de osteoclastos maduros com 10% de água sanitária antes da aquisição de imagens, enquanto os precursores de osteoclastos maturados com M-CSF tratados sem a adição do ligante RANK não apresentam fossas de reabsorção. Conclusão. Este protocolo permite a diferenciação robusta e confiável de osteoclastos humanos e pode fornecer uma solução pronta para doenças ósseas ou doenças que envolvam excesso de calcificação. Usamos osteoclastos para projetá-los ainda mais em nossas células RANK que usam um domínio de sinalização intracelular que pode ser ativado em conjunto com um indutor químico de dimerização para ativação controlada e osteoprotegerin-independente osteoclastos.
