서론파골세포는 뼈 질환 연구, 암 연구, 조직 공학 및 내보철물 연구와 같은 분야의 연구자들이 일반적으로 사용하는 다핵 세포 유형입니다. 그럼에도 불구하고 파골세포 분화는 전구체의 융합이 필요하기 때문에 어려울 수 있습니다. 또한 인간 파골세포와 IPSC를 구별하려면 다양한 생물학적 요인을 적시에 사용해야 합니다.
인간의 일차 세포에 관해서는. CD34+말초 혈액 단핵 세포는 현재 파골세포로 분화하는 데 가장 널리 사용되는 세포 유형입니다. 그러나 이 접근 방식은 CD34+ 집단 내의 이질성과 제한된 확장성으로 인해 제한됩니다.
인간 IPSC는 파골세포에 대한 대체 공급원을 제시합니다. 무한정 증식할 수 있기 때문에 파골세포 생산의 확장성과 업스케일링이 가능합니다. 이를 통해 많은 수의 파골세포를 분화할 수 있어 파골세포 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
여기에서 박사 후 연구원 Alexander Blumke와 박사 과정 학생인 Jessica Simon은 파골세포와 인간 IPSC의 차이점을 보여줍니다. P-10 또는 P-20 피펫 팁 또는 셀 스크레이퍼를 사용하여 실체현미경 아래에서 분화된 영역 또는 죽은 IPSC 응집체가 많은 영역을 제거하여 IPSC를 패스에이징하기 시작합니다. 분화된 영역은 색상이 더 조밀하고 하얗게 나타납니다.
오래된 배지로 분리된 세포를 씻어낸 다음 PBS로 남아 있는 분리된 세포를 두 번 씻어냅니다. 다음으로, 웰 당 밀리리터 디스 파세 당 5 단위의 1 밀리리터를 웰에 추가합니다. 접시에서 들어 올려진 군체의 가장자리는 3-5 분 후에 실체 현미경으로 관찰 할 수 있습니다.
dispase를 조심스럽게 제거하고 12 밀리 리터의 DMEM / F-15 HEPES를 추가합니다. 줄기 세포 통과 도구 또는 일회용 세포 리프터를 사용하여 응집체를 작은 크기로 자릅니다. 5 밀리리터 혈청학적 피펫 또는 넓은 구경 팁이 있는 P-1000을 사용하여 응집체와 함께 배지를 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
DMEM/F-12로 우물을 헹구고 배지를 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 얇게 썬 IPSC 응집체를 200G에서 3분 동안 원심분리합니다. 파스퇴르 유리 피펫으로 상층액을 제거하고 2ml의 인간 IPSC 무혈청 배지를 추가하여 5밀리리터 혈청학적 피펫 또는 넓은 구경 팁이 있는 P-1000을 사용하여 IPSC를 제거하고 재현탁합니다.
사전 코팅된 웰 플레이트에서 남은 기저막 추출물을 흡인하고 6웰 플레이트의 각 웰에 1m리터의 인간 IPSC 무혈청 배지를 추가합니다. IPSC를 6웰 플레이트의 새 웰로 옮겨 최종 부피가 웰당 2밀리리터의 인간 IPSC 무혈청 배지가 되도록 합니다. IPSC 라인에 따라 분할 비율을 최적화해야 합니다.
여기서는 1:6 분할 비율이 사용되었습니다. 웰 플레이트를 소용돌이치면 응집체가 이송된 후 플레이트 전체에 셀이 고르게 분포됩니다. 배아체 유도.
IPSC 배양물에서 오래된 배지를 흡인하고 DPBS로 웰을 헹굽니다. 실온으로 예열된 반 밀리리터를 6웰 플레이트의 각 웰에 넣고 배양 용기를 소용돌이쳐 전체 웰 표면을 코팅합니다. 배양 용기를 37°C에서 5-8분 동안 배양합니다.
인큐베이터에서 용기를 제거하고, 용액을 흡인하고, 1기 배지를 밀리리터당 50나노그램의 인간 뼈 형태 형성 단백질 4, 밀리리터당 50나노그램의 인간 혈관 내피 성장 인자 165, 밀리리터당 20나노그램의 인간 줄기 세포 인자 및 10마이크로몰 ROCK 억제제 Y-27632로 구성된 웰에 추가합니다. 1단계 배지로 웰을 헹구어 세포를 부드럽게 분리합니다. 세포를 원뿔형 튜브로 끌어당깁니다.
웰에 새로운 1단계 배지를 추가하고 셀 스크레이퍼를 사용하여 나머지 세포를 분리합니다. 모든 세포를 튜브로 옮긴 후 실온에서 200G에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 총 2 밀리리터의 사전 평형 1 단계 배지에서 세포를 흡인 및 재현탁시킵니다.
혈구계 또는 자동 세포 계수 장치를 사용하여 세포 계수 12, 100 마이크로리터의 1단계 배지에 둥근 바닥 초저 부착 96웰 플레이트에 웰당 500개의 세포를 시드합니다. 현미경으로 보면 세포가 용액 전체에 걸쳐 확산적으로 나타납니다. 96웰 플레이트를 100G에서 3분 동안 원심분리 원심분리 후 세포는 현미경으로 볼 때 스페로이드와 비슷해지기 시작해야 합니다.
접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 놓습니다. 1단계 배지로 첫째 날과 둘째 날에 배지의 절반을 교체합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 오래된 배지를 페트리 접시에 폐기합니다.
96웰 플레이트에서 미디어를 폐기한 후 실수로 제거되었을 수 있는 EB가 있는지 확인합니다. P-1000 피펫 조혈 분화를 사용하여 페트리 접시에서 실수로 제거된 EB를 다시 옮깁니다. 2 밀리 몰 울트라 글루타민, 55 마이크로 몰 베타 메르캅토 에탄올, 밀리 리터 당 25 나노 그램, 인간 인터루킨 -3 및 밀리 리터 당 100 나노 그램 인간 대식 세포 콜로니 자극 인자를 첨가 한 3 밀리리터의 2 단계 배지로 6 웰 플레이트의 웰을 미리 채웁니다.
P-1000 및 와이드 보어 팁을 사용하여 8개의 EB를 6웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 이송 후, 각 웰에 8개의 EB가 있는 것을 실체 현미경으로 눈으로 확인합니다. 5-7일 후, 조혈 세포로 구성된 부유 세포 집단이 보일 것입니다.
조혈 분화 기간은 7일부터 다양할 수 있습니다. 10일 동안의 분화는 큰 CD45+CD14+ 및 CD11b+ 하위집단으로 구성된 조혈 집단을 보여주었습니다. 2단계 배지로 5일 동안 처리한 후 기존 배지를 조심스럽게 제거하고 50밀리리터 원뿔형 튜브에 분배하여 배지 교체를 수행합니다.
즉시 1 밀리리터의 새로운 단계 2 매체를 우물에 추가하십시오. 이미 존재할 수 있는 부유 조혈 세포를 저장하려면 300G의 기존 배지로 튜브를 5분 동안 회전시킵니다. 튜브에 새로운 2단계 배지를 추가하고 기존 배지와 함께 옮겨졌을 수 있는 세포를 분리하기 위해 재현탁합니다.
이전에 1밀리리터의 2단계 배지로 채워졌던 각 웰에 저장된 세포가 있는 새로운 2단계 배지 2밀리리터를 추가합니다. 조혈 분화 10일째에 부유 조혈 세포를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 모아 채취하고 10% DMSO, 50% FBS 및 40% 배지를 사용하여 다시 얼리거나 즉시 세포를 파골세포로 추가 분화하는 데 사용할 수 있습니다. M-CSF 성숙 및 파골세포 분화.
200, 000 세포에 세포를 씨를 뿌리고 10%FBS로 보충된 알파 MEM로 3 일 동안 대우하고 M-CSF 당 50 nanograms. 기능적 분석 또는 이미징을 수행하려면 내경 팁이 넓은 P-1000으로 세척하여 MCSF 성숙 세포를 분리합니다. 오래된 배지가 있는 분리된 세포를 튜브에 옮기고 300G에서 5분 동안 회전합니다.
10 % FBS, 밀리 리터 M-CSF 당 50 나노 그램 및 밀리 리터 당 80 나노 그램 RANK 리간드가 보충 된 신선한 알파 MEM으로 세포 펠릿을 재현탁 및 용해시킵니다. 200, 000 세포 당 세포를 제곱 센티미터 당 다시 씨앗을 뿌리고 7-9 일 동안 분화하십시오. 다핵 파골세포는 일반적으로 5일에서 7일 사이에 나타납니다.
대표 결과. 생성된 조혈 세포 집단의 조성은 유세포 분석을 사용하여 분석할 수 있습니다. 여기서 조혈 세포는 CD45+전구체 세포의 큰 집단을 보여줍니다.
단핵구 마커 CD14 및 CD11b를 발현하는 세포 집단은 일반적으로 동형 대조군과 비교할 때 전체 집단의 1/3을 구성합니다. 말단 분화된 IPSC 유래 파골세포는 현미경으로 TRAP 양성 다핵 세포로 볼 수 있습니다. 컨포칼 현미경은 카텝신 K에 대한 세포 염색을 보여줍니다.뼈 또는 미네랄 흡수 분석과 같은 기능적 분석은 파골세포 활성을 추가로 정량화할 수 있습니다.
여기서 이미징 전에 10% 표백제로 성숙한 파골세포를 제거한 후 흡수 구덩이를 볼 수 있는 반면, RANK 리간드를 첨가하지 않고 처리한 M-CSF 성숙 파골세포 전구체는 흡수 구덩이를 보이지 않습니다. 결론. 이 프로토콜은 인간 파골세포의 강력하고 신뢰할 수 있는 분화를 가능하게 하며 뼈 질환 또는 과도한 석회화와 관련된 질병에 대한 기성품 솔루션을 제공할 수 있습니다. 우리는 파골세포를 사용하여 제어되고 골프로테게린과 독립적인 파골세포 활성화를 위해 이합체화의 화학적 유도제와 함께 활성화될 수 있는 세포 내 신호 전달 도메인을 사용하는 RANK 세포로 추가로 엔지니어링합니다.
