Einleitung.Osteoklasten sind ein mehrkerniger Zelltyp, der häufig von Forschern in Bereichen wie der Erforschung von Knochenkrankheiten, Krebsforschung, Gewebezüchtung und Endoprothesenforschung verwendet wird. Dennoch kann die Osteoklastendifferenzierung eine Herausforderung darstellen, da eine Fusion von Vorläufern notwendig ist. Darüber hinaus erfordert die Differenzierung menschlicher Osteoklasten von IPSCs den Einsatz einer Vielzahl biologischer Faktoren zum richtigen Zeitpunkt.
Wenn es um menschliche Primärzellen geht. CD34+periphere mononukleäre Blutzellen sind derzeit der am weitesten verbreitete Zelltyp für die Differenzierung in Osteoklasten. Dieser Ansatz ist jedoch durch die Heterogenität innerhalb der CD34+-Population und deren begrenzte Erweiterbarkeit begrenzt.
Humane IPSCs stellen eine alternative Quelle für Osteoklasten dar. Da sie unbegrenzt vermehrt werden können, ermöglichen sie eine Erweiterbarkeit und Hochskalierung der Osteoklastenproduktion. Dies ermöglicht die Differenzierung einer großen Anzahl von Osteoklasten, was die Osteoklastenforschung erleichtert.
Hier demonstrieren unser Postdoc Alexander Blumke und die Doktorandin Jessica Simon die Differenzierung von Osteoklasten von humanen IPSCs, die IPSCs passieren. Beginnen Sie mit der Passage von IPSCs, indem Sie differenzierte Regionen oder Regionen mit vielen toten IPSC-Aggregaten unter dem Stereomikroskop mit einer P-10- oder P-20-Pipettenspitze oder einem Zellschaber entfernen. Differenzierte Bereiche erscheinen dichter und weißer.
Waschen Sie die abgelösten Zellen mit altem Medium und waschen Sie dann alle verbleibenden abgelösten Zellen zweimal mit PBS weg. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter von fünf Einheiten pro Milliliter Dispase pro Vertiefung in die Vertiefung hinzu. Die Ränder der Kolonien, die sich von der Schale abheben, können nach drei bis fünf Minuten unter dem Stereomikroskop beobachtet werden.
Entfernen Sie vorsichtig die Dispase und fügen Sie einen Milliliter DMEM/F-12 mit 15-Millimolar-HEPES hinzu. Verwenden Sie ein Stammzellen-Passage-Werkzeug oder einen Einweg-Zellheber, um die Aggregate klein zu schneiden. Füllen Sie die Medien mit Aggregaten in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette oder einem P-1000 mit breiter Spitze.
Spülen Sie die Vertiefung mit DMEM/F-12 und füllen Sie das Medium in das 15-Milliliter-Röhrchen. Die in Scheiben geschnittenen IPSC-Zuschlagstoffe werden drei Minuten lang bei 200 g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteur-Glaspipette und fügen Sie zwei Milliliter humanes IPSC-serumfreies Medium hinzu, um die IPSCs mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette oder P-1000 mit breiter Spitze zu lösen und zu resuspendieren.
Saugen Sie den übrig gebliebenen Basalmembranextrakt von den vorbeschichteten Well-Platten ab und geben Sie einen Milliliter humanes IPSC-serumfreies Medium in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte. Übertragen Sie IPSCs in neue Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte, so dass das Endvolumen zwei Milliliter humanes IPSC-serumfreies Medium pro Well beträgt, wobei ein P-1000 mit breiter Bohrung verwendet wird. Je nach IPSC-Linie müssen die Split-Verhältnisse optimiert werden.
Hier wurde ein Split-Verhältnis von 1:6 verwendet. Schwenken Sie die Well-Platte, um die Zellen gleichmäßig über die Platte zu verteilen, nachdem die Aggregate übertragen wurden. Induktion des Embryoidkörpers.
Saugen Sie das alte Medium aus den IPSC-Kulturen ab und spülen Sie die Vertiefungen mit DPBS. Geben Sie einen halben Milliliter auf Raumtemperatur vorgewärmtes Wasser in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und schwenken Sie das Kulturgefäß, um die gesamte Well-Oberfläche zu beschichten. Inkubieren Sie das Kulturgefäß bei 37 Grad Celsius für fünf bis acht Minuten.
Das Gefäß wird aus dem Inkubator genommen, die Lösung abgesaugt und das Medium der Stufe 1 in Vertiefungen gegeben, die aus 50 Nanogramm pro Milliliter humanem knochenmorphogenem Protein 4, 50 Nanogramm pro Milliliter humanem vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor 165, 20 Nanogramm pro Milliliter humanem Stammzellfaktor und 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren Y-27632 bestehen. Lösen Sie die Zellen vorsichtig ab, indem Sie die Vertiefung mit einem Medium der ersten Stufe spülen. Ziehen Sie die Zellen in ein konisches Röhrchen.
Geben Sie ein neues Medium der Stufe 1 in die Vertiefungen und lösen Sie alle verbleibenden Zellen mit einem Zellschaber. Nachdem Sie alle Zellen in das Röhrchen umgefüllt haben, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 g, um die Zellen zu pelletieren. Die Zellen werden in insgesamt zwei Millilitern voräquilibriertem Medium der ersten Stufe abgesaugt und resuspendiert.
Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzählgerät Seed 12, 500 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und ultraniedrigem Aufsatz in 100 Mikrolitern Medium der ersten Stufe. Unter dem Mikroskop erscheinen die Zellen diffus in der gesamten Lösung. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platten drei Minuten lang bei 100 g Nach dem Zentrifugieren sollten die Zellen beginnen, Sphäroiden zu ähneln, wenn sie unter dem Mikroskop betrachtet werden.
Legen Sie die Platte in einen 37 Grad warmen Inkubator. Wechseln Sie die Hälfte des Mediums am ersten Tag und am zweiten Tag mit den Medien der ersten Stufe. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um altes Medium in eine Petrischale zu entsorgen.
Nachdem Sie die Medien von der 96-Well-Platte entsorgt haben, suchen Sie nach EBs, die möglicherweise versehentlich entfernt wurden. Übertragen Sie die versehentlich entfernten EBs mit einer P-1000-Pipette zur hämatopoetischen Differenzierung in die Petrischale zurück. Vorfüllen von Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit drei Millilitern Medium der Stufe zwei, zu dem zwei Millimolar Ultraglutamin, 55 Mikromolar Beta-Mercaptoethanol, 25 Nanogramm pro Milliliter, humanes Interleukin-3 und 100 Nanogramm pro Milliliter humaner Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor hinzugefügt werden.
Übertragen Sie mit einem P-1000 und einer Wide-Bore-Spitze acht EBs in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte. Nach dem Transfer wird unter dem Stereomikroskop mit dem Auge überprüft, ob sich in jeder Vertiefung acht EBs befinden. Nach fünf bis sieben Tagen sollte eine schwimmende Zellpopulation aus hämatopoetischen Zellen sichtbar werden.
Die hämatopoetische Differenzierungsperiode kann variiert werden, beginnend mit sieben Tagen. Die Differenzierung über 10 Tage ergab eine hämatopoetische Population, die sich aus großen CD45+CD14+ und CD11b+ Subpopulationen zusammensetzte. Nach fünftägiger Behandlung mit Medium der zweiten Stufe führen Sie einen Mediumwechsel durch, indem Sie das alte Medium vorsichtig entfernen und in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen abgeben.
Geben Sie sofort einen Milliliter des neuen Mediums der Stufe zwei in die Vertiefungen. Um eventuell bereits vorhandene schwimmende hämatopoetische Zellen zu retten, schleudern Sie das Röhrchen mit dem alten Medium bei 300 G fünf Minuten lang ab. Geben Sie ein neues Medium der zweiten Stufe in das Röhrchen und resuspendieren Sie es, um Zellen zu lösen, die möglicherweise mit dem alten Medium übertragen wurden.
Geben Sie zwei Milliliter des neuen Mediums der Stufe zwei mit gespeicherten Zellen in jede Vertiefung, die zuvor mit einem Milliliter des Mediums der Stufe zwei gefüllt war. Am 10. Tag der hämatopoetischen Differenzierung werden schwimmende hämatopoetische Zellen geerntet, indem sie in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt werden, und können entweder mit 10 % DMSO, 50 % FBS und 40 % Medium wieder eingefroren oder sofort zur weiteren Differenzierung der Zellen in Osteoklasten verwendet werden. M-CSF-Reifung und Osteoklastendifferenzierung.
Samenzellen bei 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter und drei Tage lang mit Alpha-MEM behandelt, ergänzt mit 10% FBS und 50 Nanogramm pro Milliliter M-CSF. Um funktionelle Assays oder Bildgebung durchzuführen, trennen Sie die MCSF-gereiften Zellen ab, indem Sie sie mit einem P-1000 mit breiter Spitze waschen. Abgelöste Zellen mit altem Medium in ein Röhrchen überführen und fünf Minuten lang bei 300 g herunterschleudern.
Resuspendieren und lösen Sie das Zellpellet mit frischem Alpha-MEM auf, das mit 10 % FBS, 50 Nanogramm pro Milliliter M-CSF und 80 Nanogramm pro Milliliter RANK-Ligand ergänzt ist. Die Zellen werden bei 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter neu ausgesät und sieben bis neun Tage lang differenziert. Mehrkernige Osteoklasten treten typischerweise am fünften bis siebten Tag auf.
Repräsentative Ergebnisse. Die Zusammensetzung der erzeugten hämatopoetischen Zellpopulation kann mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Hier zeigen hämatopoetische Zellen eine große Population von CD45+Vorläuferzellen.
Zellpopulationen, die die Monozytenmarker CD14 und CD11b exprimieren, machen im Vergleich zu Isotypkontrollen in der Regel ein Drittel der Gesamtpopulation aus. Termindifferenzierte IPSC-abgeleitete Osteoklasten können unter dem Mikroskop als TRAP-positive mehrkernige Zellen betrachtet werden. Die konfokale Mikroskopie zeigt die Färbung der Zellen für Cathepsin K. Funktionelle Assays wie Knochen- oder Mineralabsorptionsassays ermöglichen eine weitere Quantifizierung der Osteoklastenaktivität.
Hier sind Resorptionsgruben sichtbar, nachdem reifer Osteoklasten vor der Bildgebung mit 10%igem Bleichmittel entfernt wurden, während M-CSF-gereifte Osteoklastenvorläufer, die ohne Zugabe von RANK-Liganden behandelt wurden, keine Resorptionsgruben aufweisen. Schlussfolgerung. Dieses Protokoll ermöglicht die robuste und zuverlässige Differenzierung menschlicher Osteoklasten und könnte eine Standardlösung für Knochenerkrankungen oder Erkrankungen mit übermäßiger Verkalkung darstellen. Wir verwenden Osteoklasten, um sie in unsere RANK-Zellen umzuwandeln, die eine intrazelluläre Signaldomäne verwenden, die in Verbindung mit einem chemischen Dimerisierungsinduktor für eine kontrollierte und Osteoprotegerin-unabhängige Osteoklastenaktivierung aktiviert werden kann.
