עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32071135 ו 31471010), תוכנית שנגחאי פוג'יאנג (14PJ1405900), והקרן למדעי הטבע של שנחאי (19ZR1446400).

1. קביעת אתר מחשוף Cas9/sgRNA אופטימלי במעלה הזרם של cDNA/ORF
<ol><li>הכנת פלסמידים cDNA או ORF עם עמוד שדרה וקטורי זהה<ol><li>רכוש שיבוטים של cDNA/ORF הזמינים במשאבים ציבוריים, כגון מרכז המשאבים לגנום דרוזופילה (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection10,11, אוסף הגנים של יונקים עכבריים (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/), וספריית הביטוי הלנטיוויראלי הרחבה של CCSB האנושי12. בפרוטוקול זה, אנו לוקחים כדוגמה את שיבוטי cDNA/ORF מבוססי וקטור pOT2, הזמינים באוסף הזהב של DGRC.</li>
		<li>חילוץ DNA פלסמיד באמצעות ערכת הכנה קטנה פלסמיד. למדוד את הריכוז של פלסמידים עם ספקטרופוטומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>תכנון sgRNA<ol><li>בקר באתר האינטרנט של CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). לחץ על הלחצן הדבק יעד ולאחר מכן הזן את רצף ה- DNA המעניין. רצף העניין הוא אזור של 20-100 bp הממוקם בעמוד השדרה הווקטורי pOT2 במעלה הזרם של קצה cDNA/ORF 5'.</li>
		<li>בחר את המין Drosophila melanogaster. לחץ על הלחצן חפש אתרי יעד. בחר מועמדים sgRNA עם יעילות חזויה גבוהה מ 80%.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת sgRNA<ol><li>הזמנת אוליגוס מטוהר PAGE, פריימר קדמי (5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTA GAAATAG-3′) כאשר (N)20 הוא רצף המטרה של sgRNA, ושל פיגום sgRNA פריימר הפוך sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′). הערה: מומלץ להשתמש באוליגונוקלאוטידים באיכות גבוהה מטוהרים PAGE.</li>
		<li>הכן תבנית DNA על ידי PCR עבור שעתוק חוץ גופי (IVT) של sgRNA. הגדר תגובת PCR של 100 μL באופן הבא: 5 μL של תבנית pX330 (פלסמיד Addgene 42230, מתנה מפנג ז'אנג; 0.1 ng/μL), 5 μL של פריימר קדמי (10 μM), 5 μL של sgRNA-REV (10 μM), 50 μL של 2x תערובת מאסטר PCR באיכות גבוהה, ו- 35 μL של מים מטופלים דיאתיל פירוקרבונט (DEPC) בצינור PCR.</li>
		<li>בצע PCR באמצעות התנאים הבאים thermocycling: 1 מחזור של 98 ° C במשך 30 שניות; 5 מחזורים של 98 °C עבור 10 שניות, 51 °C עבור 10 s, 72 °C עבור 5 שניות; 30 מחזורים של 98 °C עבור 10 שניות, 72 °C עבור 15 שניות; מחזור אחד של 72°C למשך 2 דקות. לדגור תגובות במחזור תרמי.</li>
		<li>להפריד מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 0.8%. מקטע DNA ~ 120-bp צריך להיות גלוי על הג'ל תחת UV. לטהר את מקטע ה- DNA ~ 120-bp באמצעות ערכת מיצוי ג'ל. מקטע הדנ"א המטוהר משמש כתבנית ל-IVT של sgRNA.</li>
		<li>הגדר תגובת IVT של 5 μL באופן הבא: 165 ng של ~ 120-bp מקטע DNA ג'ל מטוהר, 1.65 μL של תערובת חיץ NTP, 0.33 μL של תערובת T7 RNA פולימראז, ומים מטופלים DEPC. לדגור תגובות ב 37 ° C במשך 4 שעות. בצע את ההוראות הידניות של ערכת תמלול חוץ גופית .</li>
		<li>יש להוסיף 45 μL של מים שטופלו ב-DEPC למוצר עם תגובת IVT. התייחסו למוצרי תגובת IVT כאל RNA והשתמשו במים שטופלו ב-DEPC כבקרה ריקה. למדוד את הריכוז של sgRNA עם ספקטרופוטומטר. הריכוז של sgRNA מדולל הוא סביב 870 ng/μL.</li>
		<li>יש לדלל את מוצר תגובת ה-IVT ל-20 ננוגרם/מיקרוליטר במים שטופלו ב-DEPC. Aliquot ולאחסן sgRNA ישירות ב -80 ° C. הערה: לאחר תגובת IVT, הסרת תבנית הדנ"א על ידי עיכול DNase אינה הכרחית למדידת הריכוז המדויק של sgRNA, מכיוון שכמות תבנית הדנ"א נמוכה מ-0.4% מזו של sgRNA ותבנית הדנ"א אינה משפיעה על תגובת CRISPRmass שלאחר מכן. לכן, טיהור sgRNA אינו הכרחי.</li>
	</ol></li>
	<li>הערכה של sgRNAs<ol><li>לעכל פלסמיד cDNA/ORF הנושא עמוד שדרה וקטורי pOT2 עם אנזים הגבלה. להפריד את קטעי ה- DNA המתקבלים על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose 0.8%. לטהר את מצע ה- DNA עם ערכת מיצוי ג'ל. הערה: מקטע DNA שנוצר המכיל את רצפי מיקוד sgRNA של עמוד השדרה הווקטורי pOT2 משמש כמצע ה- DNA של Cas9/sgRNAs. אתרי המחשוף של Cas9/sgRNA ממוקמים באופן א-סימטרי במצע הדנ"א, וכך פיצול מצע הדנ"א על ידי Cas9/sgRNA מניב שני מקטעי דנ"א בגדלים שונים, מה שמקל על ההבחנה בינם לבין מצע הדנ"א הלא תקין בתגובת העיכול.</li>
		<li>הגדר תגובת מחשוף של 5 μL Cas9 באופן הבא: 0.2 μL של 1.22 μM S. pyogenes Cas9, 0.5 μL של 20 ng/μL sgRNA, 0.015 pmol של מצע DNA, 0.5 μL של 10x Cas9 Buffer, ומים מטופלים DEPC. לדגור תגובות ב 37 ° C במשך 1 שעות.</li>
		<li>להפריד את מוצרי המחשוף על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose 0.8%. טען את מצע ה- DNA השלם כבקרה שלילית על מצע ה- DNA המעוכל. הערה: כאן, מצע DNA שלם מתייחס למצע DNA שאינו נתון לתגובות עיכול על ידי Cas9/sgRNAs. פיצול מצע הדנ"א על ידי Cas9/sgRNA מניב שני מקטעי דנ"א בגדלים שונים, מה שמקל על ההבחנה בינם לבין מצע הדנ"א הלא תקין בתגובת העיכול.</li>
		<li>נתחו דפוסי מחשוף באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית (איור 2). בחר את sgRNA היעיל ביותר עבור ניסויי CRISPRmass הבאים. איור 2 מראה שכל ארבעת ה-sgRNA מפגינים יעילות גבוהה של המחשוף, וניתן להשתמש בהם עבור CRISPRmass. בחר את sgRNA המסומן בקו תחתון עבור הניסויים הבאים. הערה: ככל שמצע הדנ"א הפנוי קטן יותר, כך ה-sgRNA יעיל יותר לעיכול Cas9/sgRNA של מצע DNA.</li>
	</ol></li>
</ol>2. בניית מודול כטב"ם
הערה: מודול כטב"ם מורכב מכטב"ם ליבה וכ-20-40 bp של רצפי הטרמינלים 5′ ו-3′ החופפים לקצוות 5′ ו-3′ של אתר המחשוף בעמוד השדרה, בהתאמה (איור 1). רצפי הטרמינל 5′ ו-3′ של מודול המל"ט נקבעים על ידי אתר המחשוף בעמוד השדרה של וקטור pOT2.
<ol><li>שכפל את מודול הכטב"ם הספציפי לווקטור pOT2 לאתר EcoRI של וקטור pCR8GW, וכתוצאה מכך pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 פלסמיד (קובץ משלים 1). שחרר את מודול הכטב"ם הספציפי לווקטור pOT2 על ידי עיכול פלסמיד pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 עם EcoRI ב-37°C למשך שעה אחת.</li>
	<li>להפריד את מוצרי המחשוף על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 0.7%. טהרו את מודול הכטב"ם 6178-bp באמצעות ערכת מיצוי ג'ל. דללו את מודול הכטב"ם ל-23 ננוגרם/מיקרוליטר לניסויים הבאים. מקטע 6178-bp זה משמש כמודול כטב"ם לבניית פלסמידים מבוססי UAS-cDNA/ORF משיבוטים מבוססי cDNA/ORF מבוססי וקטור pOT2.</li>
</ol>3. בנייה בקנה מידה גדול של פלסמידים UAS-cDNA/ORF על ידי CRISPRmass
הערה: CRISPRmass מתוקנן כתגובות מבחנה דו-שלביות מקבילות באופן מאסיבי לפני טרנספורמציית E. coli (איור 1).
<ol><li>תגובת מבחנה שלב 1<ol><li>לבקע את עמוד השדרה הווקטורי הזהה של פלסמידים cDNA/ORF על ידי Cas9/sgRNA. סדרו צינורות 0.2 מ"ל בבלוק קירור אלומיניום על קרח ותייגו את הצינורות בזהירות. הכינו את תערובת המאסטר באופן הבא.<ol><li>לתגובה יחידה, יש להוסיף 0.16 μL של 1.22 μM S. pyogenes Cas9, 0.4 μL של 20 ng/μL sgRNA, 0.24 μL של 10x Cas9 buffer, 1.2 μL של מים שטופלו ב-DEPC. עבור N תגובות, הוסף (N+1) x 0.16 μL של 1.22 מיקרומטר S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0.4 μL של 20 ng/μL sgRNA, (N+1) x 0.24 μL של 10x Cas9 buffer, (N+1) x 1.2 μL של מים שטופלו ב-DEPC.</li>
		</ol></li>
		<li>מערבלים, מערבבים היטב, ומסתחררים. Aliquot 2 μL של תערובת מאסטר לכל צינור. הוסף 0.4 μL של 0.019 מיקרומטר של פלסמיד cDNA/ORF לכל צינור. יש לדגור על תגובות מחשוף בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת. הערה: יש לדלל כל פלסמיד ל-0.019 מיקרומטר במים שטופלו ב-DEPC. אם ריכוז הפלסמיד נמוך מ-0.019 מיקרומטר, יש להוסיף DNA פלסמיד ישירות לתגובת המחשוף. השתמש בצינורות נטולי RNase ובמים שטופלו ב- DEPC. ביצוע שלבים אלה בקנה מידה גדול ייקח מספר שעות. אלא אם כן צוין אחרת, שמור ריאגנטים ותגובות על קרח.</li>
	</ol></li>
	<li>תגובת מבחנה שלב 2<ol><li>הכנס מודול UAS ספציפי לווקטור משלב 2 לתוך פלסמידים cDNA/ORF ליניאריים Cas9 על ידי הרכבת תגובה חד-שלבית. הגדר תגובה של 1.4 μL בצעד אחד עבור כל דגימה. סדרו את צינורות ה-0.2 מ"ל בבלוק קירור מאלומיניום על קרח ותייגו את הצינורות בזהירות.<ol><li>הכינו את תערובת המאסטר באופן הבא. עבור תגובה יחידה, הוסף 0.07 μL של מודול UAS 0.006 μM ו- 0.7 μL של תערובת מאסטר להרכבה של תגובה חד-שלבית. עבור N תגובות, הוסף (N+1) x 0.07 μL של מודול UAS של 0.006 μM ו- (N+1) x 0.7 μL של תערובת מאסטר להרכבת תגובה חד-שלבית.</li>
		</ol></li>
		<li>מערבלים, מערבבים היטב, ומסתחררים. Aliquot 0.77 μL של תערובת המאסטר לכל צינור. הוסף 0.7 μL של פלסמיד cDNA/ORF ליניארי Cas9 לכל צינור. לדגור תגובות ב 50 ° C במשך 1 שעה. הערה: אין צורך בטיהור של מוצרי תגובת הרכבה חד-שלבית. ביצוע שלבים אלה בקנה מידה גדול לוקח כמה שעות. אלא אם כן צוין אחרת, שמור ריאגנטים ותגובות על קרח.</li>
	</ol></li>
	<li>הפוך מוצרי תגובת הרכבה חד-שלבית ל-E. coli בקנה מידה גדול.<ol><li>Prechill 10 μL טיפים ב 4 °C. צינורות Prechill 1.5 מ"ל בבלוק קירור אלומיניום על קרח.</li>
		<li>הפשירו תאי E. coli מוכשרים על קרח במשך 5 דקות. Aliquot 10 μL של תאים מוסמכים לכל צינור precooled 1.5 מ"ל. הערה: השתמש בתאי E. coli מוכשרים הזמינים מסחרית עם יעילות טרנספורמציה של לפחות 1 x 108 CFU/μg של pUC19 DNA.</li>
		<li>יש להוסיף 1 μL של מוצר תגובת הרכבה בצעד אחד ל-10 μL של תאים מתאימים, לערבב בעדינות ולהניחו על קרח למשך 30 דקות.</li>
		<li>לדגור את הצינורות באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ולאחר מכן מיד לצנן על קרח במשך 2 דקות.</li>
		<li>יש להוסיף 100 μL של SOC בינוני (שחומם מראש ל-37°C) לכל צינור בטמפרטורת החדר, ולדגור באינקובטור רועד (250 סל"ד) ב-37°C למשך שעה אחת.</li>
		<li>חממו עד 37 מעלות צלזיוס את לוחות LB המכילים אנטיביוטיקה המתאימה לגן העמידות לאנטיביוטיקה של מודול המל"ט. פזרו תאים על הצלחות ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה. הערה: ביצוע שלבים אלה בקנה מידה גדול אורך מספר שעות. אלא אם כן צוין אחרת, שמור ריאגנטים ותגובות על קרח.</li>
	</ol></li>
	<li>אימות פלסמידים מסוג UAS-cDNA/ORF שנבנו על ידי CRISPRmass<ol><li>בחר מושבה אחת וחסן אותה ב 4.5 מ"ל של מדיום נוזלי LB בתוספת הבחירה המתאימה של אנטיביוטיקה המתאימה לגן עמידות לאנטיביוטיקה של מודול UAS. יש לדגור למשך הלילה ב-37°C תוך רעידות ב-250 סל"ד.</li>
		<li>לחלץ DNA פלסמיד באמצעות ערכת הכנת פלסמיד מיני. הגדר תגובת עיכול הגבלה של 20 μL באופן הבא: 300-500 ng/μL של פלסמיד, אנזים הגבלה מתאים, חיץ הגבלת עיכול ומים טהורים במיוחד. לדגור תגובות ב 37 ° C במשך 1 שעות.</li>
		<li>הפרידו מקטעי דנ"א באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ב-0.8% ונתחו באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית (איור 3).</li>
	</ol></li>
</ol>

בניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF בעלת תפוקה גבוהה באמצעות CRISPRmass

<ol>
	<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+eukaryotes.">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li><li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster.">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86 (4), 521-529 (1996).</li><li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+Drosophila+melanogaster.">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Bischof, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+platform+for+creating+a+comprehensive+UAS-ORFeome+library+in+Drosophila.">A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila.</a> Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).</li><li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+functional+approach+to+uncover+human+genes+and+pathways+in+Drosophila.">A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila.</a> Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).</li><li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA/ORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans.">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+complementary+DNA+resource.">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).</li><li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+collection:+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%+of+D.+melanogaster+genes.">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs.">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השלבים הקריטיים ביותר של CRISPRmass הם תכנון של sgRNA והערכה של sgRNAs. בחירה של sgRNA יעיל במיוחד עבור Cas9 היא המפתח להצלחה של CRISPRmass. אם מעט מאוד מושבות או בכלל לא נצפות על רוב לוחות LB המכילים אנטיביוטיקה לאחר השינוי של E. coli עם מוצרי הרכבה תגובה בצעד אחד, לבדוק עיכול פלסמיד על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. אם פ...

סריקה גנטית בלתי משוחדת של גנום שלם היא גישה רבת עוצמה לזיהוי גנים המעורבים בתהליך ביולוגי נתון ולהבהרת המנגנון שלו. לכן, הוא נמצא בשימוש נרחב בתחומים שונים של מחקר ביולוגי. כ-60% מהגנים של דרוזופילה נשמרים בבני אדם 1,2, ו~75% מהגנים של מחלות אנושיות מכילים הומולוגים בדרוזופילה3. בדיקות סקר גנטיות נחלקות בעיקר לשני סוגים: אובדן תפקוד (LOF) ושיפור תפקוד (GOF). המסכים הגנטיים של LOF בדרוזופילה מילאו תפקיד קריטי בהבהרת מנגנונים השולטים כמעט בכל היבט של הביולוגיה. עם זאת, לרוב הגנים של דרוזופילה אין פנוטיפים ברורים של LOF4, ולכן, בדיקת GOF היא שיטה חשובה לחקר תפקודם של גנים אלה 4,5.
המערכת הבינארית GAL4/UAS משמשת בדרך כלל לביטוי גנים ספציפיים לרקמות בדרוזופילה6. במערכת זו, הרקמה מבטאת באופן ספציפי מפעיל שעתוק שמרים GAL4 הנקשר לאלמנט המגיב GAL4 (UAS) ובכך מפעיל שעתוק של המרכיבים הגנטיים במורד הזרם (למשל, cDNA ו- ORF)6. כדי לבצע מסכי GOF רחבי גנום בדרוזופילה, עלינו לבנות ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF רחבת גנום, ולאחר מכן ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית בדרוזופילה.
בניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF רחבת גנום בשיטות קונבנציונליות משיבוטים cDNA/ORF הזמינים לציבור היא גוזלת זמן ומייגעת, מכיוון שכל גן דורש עיצובים אינדיבידואליים, כולל תכנון וסינתזה ראשוניים, תגובת שרשרת פולימראז (PCR), טיהור ג'ל, ריצוף, הגבלת עיכול וכן הלאה 7,8. לכן, בניית ספריית פלסמיד כזו היא צעד מגביל קצב ביצירת ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית רחבת גנום בדרוזופילה. לאחרונה, פתרנו בהצלחה בעיה זו על ידי פיתוח שיטה חדשנית, הרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass)9. הליבה של CRISPRmass היא לתפעל את הרצפים הווקטוריים המשותפים של ספריית פלסמיד באמצעות שילוב של טכנולוגיית עריכת גנים וטכנולוגיית שיבוט חלקה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור CRISPRmass, הכולל תגובות מבחנה מקבילות מאסיביות בשני שלבים ואחריו טרנספורמציה חיידקית. CRISPRmass היא שיטה פשוטה, מהירה, יעילה וחסכונית, שבאופן עקרוני ניתן להשתמש בה לבניית תפוקה גבוהה של ספריות פלסמיד שונות.
אסטרטגיית CRISPRmass ההליך של CRISPRmass מתחיל בתגובות מבחנה מקבילות בשני שלבים לפני טרנספורמציית Escherichia coli (E. coli) (איור 1). שלב 1 הוא הפיצול של עמוד השדרה הווקטורי הזהה של פלסמידים cDNA/ORF על ידי Cas9/sgRNA. אתר מחשוף אידיאלי צמוד לקצה 5′ של cDNA/ORF. מוצרי המחשוף אינם חייבים להיות מטוהרים. שלב 2 הוא החדרת מודול כטב"ם ספציפי לווקטור לתוך פלסמידים cDNA/ORF ליניאריים Cas9/sgRNA על ידי הרכבת גיבסון (להלן תגובה חד-שלבית), וכתוצאה מכך פלסמידים של UAS-cDNA/ORF. רצפי הטרמינלים 5′ ו-3′ של מודול כטב"ם חופפים לאלה של פלסמידים cDNA/ORF ליניאריים, ומאפשרים תגובה חד-שלבית.
תוצרי התגובה החד-שלבית נתונים ישירות לטרנספורמציה של E. coli . תיאורטית, רק מושבות UAS-cDNA/ORF הרצויות יכולות לגדול על לוחות לוריא-ברטאני (LB) המכילים אנטיביוטיקה ברירה המתאימה לגן העמידות לאנטיביוטיקה של מודול הכטב"ם. מודול הכטב"ם מורכב ממודול ליבה של כטב"מים, גן עמידות לאנטיביוטיקה הנבדל מזה של פלסמידים cDNA או ORF, ורצפים טרמינליים 5′ ו-3′. מודול ליבה של כטב"ם כולל 10 עותקים של כטב"ם, מקדם מינימלי Hsp70, רצף attB לאינטגרציה גנומית בתיווך phiC31, וסמן טרנספורמציה מיני לבן עבור דרוזופילה7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum Cooling Block</td>
			<td>Aikbbio</td>
			<td>ADMK-0296</td>
			<td>To perform bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D2500</td>
			<td>To purify DNA from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>2500B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D6943</td>
			<td>To isolate plasmid DNA from bacterial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>Shanghai Zhichu&#160;</td>
			<td>ZQLY-180V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T series Multi-Block Thermal Cycler</td>
			<td>LongGene</td>
			<td>T20</td>
			<td>To perform PCR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans10 Chemically Competent Cell</td>
			<td>TranGen BioTech</td>
			<td>CD101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>BioSpec-nano</td>
			<td>To measure concentration of DNA or RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-based modular assembly for high-throughput construction of a uas-cdna/orf plasmid library

בדיקת גנומיקה פונקציונלית מציעה גישה רבת עוצמה לתפקוד גנים ומסתמכת על בניית ספריות פלסמיד רחבות גנום. גישות קונבנציונליות לבניית ספריית פלסמיד גוזלות זמן ומייגעות. לכן, פיתחנו לאחרונה שיטה פשוטה ויעילה, הרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass), לבניית תפוקה גבוהה של ספריית פלסמיד במעלה הזרם המפעילה רצף דנ"א משלים/מסגרת קריאה פתוחה (UAS-cDNA/ORF). כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור CRISPRmass, תוך לקיחת כדוגמה את הבנייה של ספריית פלסמיד מבוססת GAL4/UAS UAS-cDNA/ORF. הפרוטוקול כולל תגובות מבחנה דו-שלביות מקבילות באופן מאסיבי ולאחריהן טרנספורמציה חיידקית. השלב הראשון הוא לינאריות של פלסמידים קיימים של DNA משלים (cDNA) או מסגרת קריאה פתוחה (ORF) cDNA או ספריית ORF על ידי חיתוך הרצפים הווקטוריים המשותפים במעלה הזרם הסמוכים לקצה 5' של cDNA או ORFs באמצעות CRISPR/Cas9 יחד עם RNA מנחה יחיד (sgRNA), והשלב השני הוא החדרת מודול UAS לתוך פלסמידים cDNA ליניארי או ORF באמצעות תגובה חד שלבית. CRISPRmass מאפשר בנייה פשוטה, מהירה, יעילה וחסכונית של ספריות פלסמיד שונות. ספריית הפלסמיד UAS-cDNA/ORF יכולה לשמש לבדיקת רווח תפקוד בתאים בתרבית ולבניית ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית רחבת גנום בדרוזופילה.

Unbiased whole-genome genetic screening is a powerful approach for identifying genes involved in a given biological process and elucidating its mechanism. Therefore, it is widely used in various fields of biological research. Approximately 60% of Drosophila genes are conserved in humans1,2, and ~75% of human disease genes have homologs in Drosophila3. Genetic screening is mainly divided into two types: loss of function (LOF) and gain of function (GOF). LOF genetic screens in Drosophila have played a critical role in elucidating mechanisms that govern nearly every aspect of biology. However, the majority of Drosophila genes do not have obvious LOF phenotypes4, and therefore, GOF screening is an important method for studying the function of those genes4,5.
The binary GAL4/UAS system is commonly used for tissue-specific gene expression in Drosophila6. In this system, the tissue specifically expresses yeast transcription activator GAL4 that binds to the GAL4 responsive element (UAS) and thereby activates transcription of the downstream genetic components (e.g., cDNA and ORF)6. To perform genome-wide GOF screens in Drosophila, we need to construct a genome-wide UAS-cDNA/ORF plasmid library and, subsequently, a transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila.
Construction of a genome-wide UAS-cDNA/ORF plasmid library by conventional methods from publicly available cDNA/ORF clones is time-consuming and laborious, as every gene requires individualized designs, including primer design and synthesis, polymerase chain reaction (PCR), and gel purification, sequencing, restriction digestion, and so on7,8. Therefore, the construction of such a plasmid library is a rate-limiting step in creating a genome-wide transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila. Recently, we successfully solved this problem by developing a novel method, CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass)9. The core of CRISPRmass is to manipulate the shared vector sequences of a plasmid library through a combination of gene editing technology and seamless cloning technology.
Here, we present a protocol for CRISPRmass, which includes massively parallel two-step test tube reactions followed by bacterial transformation. CRISPRmass is a simple, fast, efficient, and cost-effective method that, in principle, can be used for high-throughput construction of various plasmid libraries.
CRISPRmass strategy 
The procedure of CRISPRmass starts with parallel two-step test tube reactions prior to Escherichia coli (E. coli) transformation (Figure 1). Step 1 is the cleavage of the identical vector backbones of the cDNA/ORF plasmids by Cas9/sgRNA. An ideal cleavage site is adjacent to the 5&#8242; end of cDNA/ORF. The cleavage products do not have to be purified. Step 2 is the insertion of a vector-specific UAS module into the Cas9/sgRNA linearized cDNA/ORF plasmids by Gibson assembly (hereafter referred to as single step reaction), resulting in UAS-cDNA/ORF plasmids. The 5&#8242; and 3&#8242; terminal sequences of a UAS module overlap with those of the linearized cDNA/ORF plasmids, enabling the single step reaction.
The single step reaction products are directly subjected to E. coli transformation. Theoretically, only the desired UAS-cDNA/ORF colonies can grow on Luria-Bertani (LB) plates that contain selection antibiotics corresponding to the antibiotic resistance gene of the UAS module. The UAS module is composed of a core UAS module, an antibiotic resistance gene distinct from that of cDNA or ORF plasmids, and the 5&#8242; and 3&#8242; terminal sequences. A core UAS module comprises 10 copies of UAS, an Hsp70 minimal promoter, an attB sequence for phiC31-mediated genomic integration, and a mini-white transformation marker for Drosophila7.

Author Spotlight: פישוט בניית ספריית פלסמיד רחבת גנום באמצעות CRISPRmass

הרכבה מודולרית מבוססת CRISPR לבניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF

Functional genomic screening offers a powerful approach to probe gene function, and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. Conventional approaches for plasmid library construction are time-consuming and laborious. To address this question, we develop a simple and efficient method, CRISPR-based modular assembly, or CRISPRmass.Through cleavage of shared vector sequences of cDNA or ORF plasmid by CRISPR/Cas9 and subsequent insertion of UAS modules by adjacent assembly, the procedure of construction of a genome-wide plasmid library by CRISPRmass is standardized as massively parallel two-step test tube reactions before bacterial transformation. CRISPRmass allows the simple, fast, efficient, and cost-effective construction of various plasmid libraries. It can also be applied to editing various genome-wide plasmid libraries in general, and it's an alternative to gateway technology in high-throughput plasmid library editing, paving the way for the global studies of biological networks.

יישמנו את CRISPRmass כדי ליצור ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF רחבת גנום באמצעות 3402 שיבוטים של cDNA/ORF הנושאים עמוד שדרה וקטורי pOT2 מאוסף הזהב של DGRC. ניתחנו באופן אקראי רק מושבה אחת עבור כל מבנה UAS-cDNA/ORF, וניתוח הגבלות עוקב עם PstI הצביע על כך ש-98.6% ממבני UAS-cDNA/ORF נוצרו בהצלחה9. הרציונל לשימוש ב- PstI לניתו...

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass), שיטה לבנייה בתפוקה גבוהה של ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF בדרוזופילה תוך שימוש במשאבי cDNA/ORF הזמינים לציבור. CRISPRmass ניתן ליישם על עריכת ספריות פלסמיד שונות.

Functional genomics screening offers a powerful approach to probe gene function and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. ...

סינון גנומי פונקציונלי מציע גישה רבת עוצמה לתפקוד גנים בוחנים, ומסתמך על בניית ספריות פלסמיד רחבות גנום. גישות קונבנציונליות לבניית ספריית פלסמיד גוזלות זמן ומייגעות. כדי לענות על שאלה זו, אנו מפתחים שיטה פשוטה ויעילה, הרכבה מודולרית מבוססת קריספר, או CRISPRmass.באמצעות פיצול רצפים וקטוריים משותפים של פלסמיד cDNA או ORF על ידי CRISPR/Cas9 והחדרה לאחר מכן של מודולי UAS על ידי הרכבה סמוכה, הליך הבנייה של ספריית פלסמיד רחבת גנום על ידי CRISPRmass מתוקנן כתגובות מבחנה דו-שלביות מקבילות מסיביות לפני טרנספורמציה חיידקית. CRISPRmass מאפשר בנייה פשוטה, מהירה, יעילה וחסכונית של ספריות פלסמיד שונות. ניתן ליישם אותו גם בעריכת ספריות פלסמיד שונות ברחבי הגנום באופן כללי, והוא מהווה חלופה לטכנולוגיית שער בעריכת ספריות פלסמיד בתפוקה גבוהה, וסולל את הדרך למחקרים גלובליים של רשתות ביולוגיות.

crispr-based-modular-assembly-for-high-throughput-construction-uas

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR-Based Modular Assembly for High-Throughput Construction of a UAS-cDNA/ORF Plasmid Library

504 Views.  University of South China. סינון גנומי פונקציונלי מציע גישה רבת עוצמה לתפקוד גנים בוחנים, ומסתמך על בניית ספריות פלסמיד רחבות גנום. גישות קונבנציונליות לבניית ספריית פלסמיד גוזלות זמן ומייגעות. כדי לענות על שאלה זו, אנו מפתחים שיטה פשוטה ויעילה, הרכבה מודולרית מבוססת קריספר, או CRISPRmass.באמצעות פיצ...

Video: Author Spotlight: פישוט בניית ספריית פלסמיד רחבת גנום באמצעות CRISPRmass

Functional genomics screening offers a powerful approach to probe gene function and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. Conventional approaches for plasmid library construction are time-consuming and laborious. Therefore, we recently developed a simple and efficient method, CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass), for high-throughput construction of a genome-wide upstream activating sequence-complementary DNA/open reading frame (UAS-cDNA/ORF) plasmid library. Here, we present a protocol for CRISPRmass, taking as an example the construction of a GAL4/UAS-based UAS-cDNA/ORF plasmid library. The protocol includes massively parallel two-step test tube reactions followed by bacterial transformation. The first step is to linearize the existing complementary DNA (cDNA) or open reading frame (ORF) cDNA or ORF library plasmids by cutting the shared upstream vector sequences adjacent to the 5&#39; end of cDNAs or ORFs using CRISPR/Cas9 together with single guide RNA (sgRNA), and the second step is to insert a UAS module into the linearized cDNA or ORF plasmids using a single step reaction. CRISPRmass allows the simple, fast, efficient, and cost-effective construction of various plasmid libraries. The UAS-cDNA/ORF plasmid library can be utilized for gain-of-function screening in cultured cells and for constructing a genome-wide transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila.&#160;

We present a protocol for CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass), a method for high-throughput construction of UAS-cDNA/ORF plasmid library in Drosophila using publicly available cDNA/ORF resources. CRISPRmass can be applied to editing various plasmid libraries.

Large-Scale Construction of UAS-cDNA/ORF Plasmids by CRISPR-Based Modular Assembly (CRISPRmass)

בנייה בקנה מידה גדול של פלסמידים UAS-cDNA/ORF על ידי הרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass)

Large-Scale Transformation of UAS-cDNA/ORF Plasmids from CRISPR-Based Modular Assembly into E. coli

To transform the UAS cDNA/ORF plasmids products obtained from the CRISPR based modular assembly into Escherichia coli, pre-chill 10 microliter tips at four degrees Celsius. Also, pre-chill 1.5 milliliter tubes in an aluminum cooling block on ice. After thawing competent E.coli cells on ice for five minutes, add an aliquot of 10 microliters of the cells to each pre-chilled 1.5-milliliter tube.Then add one microliter of the UAS cDNA/ORF plasmid products to each tube containing 10 microliters of competent cells. Swirl the tube gently to mix and place it on ice for 30 minutes. Incubate the tubes at 42 degrees Celsius in a water bath for one minute.Then immediately chill on ice for two minutes. Add 100 microliters of SOC medium, prewarmed to 37 degrees Celsius, to each tube at room temperature and incubate the tubes in a shaking incubator at 250 RPM and 37 degrees Celsius for one hour. Next, warm the LB plates containing an antibiotic corresponding to the UAS module's antibiotic resistance gene to 37 degrees Celsius.Spread the cells onto the warm plates and incubate them at 37 degrees Celsius overnight.