Este trabalho foi patrocinado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32071135 e 31471010), pelo Programa Pujiang de Xangai (14PJ1405900) e pela Fundação de Ciências Naturais de Xangai (19ZR1446400).

1. Determinação do local ideal de clivagem de Cas9 / sgRNA a montante do cDNA / ORF
<ol><li>Preparação de plasmídeos de cDNA ou ORF com estrutura vetorial idêntica<ol><li>Compre clones de cDNA / ORF que estão disponíveis em recursos públicos, como o centro de recursos do genoma de Drosophila (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection10,11, a coleção de genes de mamíferos de camundongos (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) e a biblioteca de expressão lentiviral CCSB humana12. Neste protocolo, tomamos como exemplo os clones de cDNA/ORF baseados em vetores pOT2, que estão disponíveis na DGRC Gold Collection.</li>
		<li>Extraia o DNA do plasmídeo usando um kit de mini-preparação de plasmídeo. Medir a concentração de plasmídeos com um espectrofotómetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Desenho de sgRNAs<ol><li>Visite o site do CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). Clique no botão Colar alvo e, em seguida, insira a sequência de DNA de interesse. A sequência de interesse é uma região de 20-100 pb localizada no esqueleto do vetor pOT2 a montante da extremidade cDNA / ORF 5 '.</li>
		<li>Escolha a espécie Drosophila melanogaster. Clique no botão Localizar sites de destino. Escolha candidatos a sgRNA com uma eficiência prevista superior a 80%.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de sgRNAs<ol><li>Ordem oligos purificados por PAGE, um primer direto (5 '-TAATACGACTCACTATAGG (N) 20GTTTTAGAGCTA GAAATAG-3 ′) onde (N) 20 é a sequência alvo de um sgRNA, e um sgRNA scaffold reverse primer sgRNA-REV (5 ′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3 ′). NOTA: Recomende o uso de oligonucleotídeos de alta qualidade purificados por PAGE.</li>
		<li>Preparar um molde de DNA por PCR para transcrição in vitro (IVT) de sgRNA. Configure uma reação de PCR de 100 μL da seguinte forma: 5 μL de modelo pX330 (plasmídeo Addgene 42230, um presente de Feng Zhang; 0,1 ng/μL), 5 μL de primer direto (10 μM), 5 μL de sgRNA-REV (10 μM), 50 μL de 2x mistura mestre de PCR de alta fidelidade e 35 μL de água tratada com dietil pirocarbonato (DEPC) em um tubo de PCR.</li>
		<li>Realizar a PCR utilizando as seguintes condições de termociclagem: 1 ciclo a 98 °C durante 30 s; 5 ciclos de 98 °C por 10 s, 51 °C por 10 s, 72 °C por 5 s; 30 ciclos de 98 °C durante 10 s, 72 °C durante 15 s; 1 ciclo de 72 °C durante 2 min. Incube reações em um termociclador.</li>
		<li>Separe os produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose a 0,8%. Um fragmento de DNA de ~ 120 pb deve ser visível no gel sob UV. Purifique o fragmento de DNA de ~ 120 pb usando um kit de extração de gel. O fragmento de DNA purificado serve como modelo para a IVT do sgRNA.</li>
		<li>Configure uma reação IVT de 5 μL da seguinte forma: 165 ng de fragmento de DNA de gel purificado de ~ 120 pb, 1,65 μL de mistura de tampão NTP, 0,33 μL de mistura de RNA polimerase T7 e água tratada com DEPC. Incubar reações a 37 °C durante 4 h. Siga as instruções manuais de um kit de transcrição in vitro .</li>
		<li>Adicione 45 μL de água tratada com DEPC ao produto da reação IVT. Trate os produtos da reação IVT como RNA e use água tratada com DEPC como controle em branco. Meça a concentração de sgRNA com um espectrofotômetro. A concentração de sgRNA diluído é de cerca de 870 ng/μL.</li>
		<li>Diluir o produto da reação IVT a 20 ng/μL com água tratada com DEPC. Alíquota e armazene o sgRNA diretamente a -80 °C. NOTA: Após a reação IVT, a remoção do molde de DNA pela digestão da DNase não é necessária para medir a concentração precisa de sgRNA, pois a quantidade do molde de DNA é inferior a 0,4% da do sgRNA e o molde de DNA não afeta a reação subsequente de massa CRISPR. Portanto, a purificação do sgRNA não é necessária.</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação de sgRNAs<ol><li>Digerir um plasmídeo cDNA/ORF contendo estrutura de vetor pOT2 com uma enzima de restrição. Separe os fragmentos de DNA resultantes por eletroforese em gel de agarose a 0,8%. Purifique o substrato de DNA com um kit de extração de gel. NOTA: Um fragmento de DNA resultante contendo as sequências de direcionamento de sgRNA do esqueleto do vetor pOT2 serve como substrato de DNA de Cas9 / sgRNAs. Os locais de clivagem de Cas9 / sgRNAs estão localizados assimetricamente no substrato de DNA e, portanto, a clivagem do substrato de DNA por Cas9 / sgRNAs produz dois fragmentos de DNA de tamanhos diferentes, o que os torna mais fáceis de distinguir do substrato de DNA não clivado na reação de digestão.</li>
		<li>Configure uma reação de clivagem Cas9 de 5 μL da seguinte forma: 0,2 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 0,5 μL de 20 ng/μL de sgRNA, 0,015 pmol de substrato de DNA, 0,5 μL de tampão Cas9 10x e água tratada com DEPC. Incubar as reações a 37 °C durante 1 h.</li>
		<li>Separe os produtos de clivagem por eletroforese em gel de agarose a 0,8%. Carregue o substrato de DNA intacto como um controle negativo para o substrato de DNA digerido. NOTA: Aqui, substrato de DNA intacto refere-se ao substrato de DNA que não é submetido a reações de digestão por Cas9 / sgRNAs. A clivagem do substrato de DNA por Cas9 / sgRNAs produz dois fragmentos de DNA de tamanhos diferentes, o que os torna mais fáceis de distinguir do substrato de DNA não clivado na reação de digestão.</li>
		<li>Analise os padrões de clivagem por um sistema de imagem digital (Figura 2). Selecione o sgRNA mais eficiente para experimentos CRISPRmass subsequentes. A Figura 2 mostra que todos os quatro sgRNAs exibem alta eficiência de clivagem e podem ser usados para CRISPRmass. Selecione o sgRNA sublinhado para experimentos subsequentes. NOTA: Quanto menor for o substrato de DNA não clivado, mais eficiente será o sgRNA para a digestão de Cas9 / sgRNA do substrato de DNA.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Construção de um módulo UAS
NOTA: Um módulo UAS compreende um UAS central e cerca de 20-40 bp das sequências terminais 5 'e 3' sobrepostas às extremidades 5 'e 3' do local de clivagem da espinha dorsal, respectivamente (Figura 1). As sequências terminais 5 'e 3' do módulo UAS são determinadas pelo local de clivagem da espinha dorsal do vetor pOT2.
<ol><li>Clone o módulo UAS específico do vetor pOT2 no local EcoRI do vetor pCR8GW, resultando no plasmídeo pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 (Arquivo Suplementar 1). Liberar o módulo UAS específico do vetor pOT2 por digestão do plasmídeo pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 com EcoRI a 37 °C por 1 h.</li>
	<li>Separe os produtos de clivagem por eletroforese em gel de agarose a 0,7%. Purifique o módulo UAS de 6178 pb com um kit de extração de gel. Diluir o módulo UAS a 23 ng/μL para experimentos subsequentes. Este fragmento de 6178 pb serve como um módulo UAS para a construção de plasmídeos UAS-cDNA/ORF a partir de clones de cDNA/ORF baseados em vetor pOT2.</li>
</ol>3. Construção em larga escala de plasmídeos UAS-cDNA/ORF por CRISPRmass
NOTA: CRISPRmass é padronizado como reações massivamente paralelas em tubo de ensaio de duas etapas antes da transformação de E. coli (Figura 1).
<ol><li>Etapa 1 da reação do tubo de ensaio<ol><li>Clivar os esqueletos vetoriais idênticos dos plasmídeos cDNA / ORF por Cas9 / sgRNA. Disponha os tubos de 0,2 mL em um bloco de resfriamento de alumínio sobre gelo e etiquete os tubos com cuidado. Prepare a mistura principal da seguinte maneira.<ol><li>Para uma única reação, adicione 0,16 μL de 1,22 μM de S. pyogenes Cas9, 0,4 μL de 20 ng/μL de sgRNA, 0,24 μL de tampão 10x Cas9, 1,2 μL de água tratada com DEPC. Para reações N, adicione (N + 1) x 0,16 μL de 1,22 μM S. pyogenes Cas9, (N + 1) x 0,4 μL de 20 ng / μL de sgRNA, (N + 1) x 0,24 μL de 10x tampão Cas9, (N + 1) x 1,2 μL de água tratada com DEPC.</li>
		</ol></li>
		<li>Vórtice, misture bem e gire para baixo. Alíquota de 2 μL de master mix para cada tubo. Adicione 0,4 μL de 0,019 μM de plasmídeo cDNA/ORF a cada tubo. Incubar reações de clivagem a 37 °C durante 1 h. NOTA: Dilua cada plasmídeo a 0,019 μM com água tratada com DEPC. Se a concentração de um plasmídeo for inferior a 0,019 μM, adicione DNA de plasmídeo diretamente à reação de clivagem. Use tubos sem RNase e água tratada com DEPC. A execução dessas etapas em grande escala levará várias horas. Salvo indicação em contrário, manter os reagentes e as reações no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Etapa 2 de reação do tubo de ensaio<ol><li>Insira um módulo UAS específico do vetor da etapa 2 nos plasmídeos cDNA/ORF linearizados Cas9 por meio do conjunto de reação de etapa única. Configure uma reação de etapa única de 1,4 μL para cada amostra. Disponha os tubos de 0,2 mL em um bloco de resfriamento de alumínio no gelo e rotule os tubos com cuidado.<ol><li>Prepare a mistura principal da seguinte maneira. Para uma única reação, adicione 0,07 μL de módulo UAS de 0,006 μM e 0,7 μL de master mix de montagem de reação de etapa única. Para reações N, adicione (N+1) x 0,07 μL de módulo UAS de 0,006 μM e (N+1) x 0,7 μL de master mix de montagem de reação de etapa única.</li>
		</ol></li>
		<li>Vórtice, misture bem e gire para baixo. Alíquota de 0,77 μL da mistura principal para cada tubo. Adicione 0,7 μL de plasmídeo cDNA/ORF linearizado Cas9 a cada tubo. Incubar reações a 50 °C durante 1 h. NOTA: A purificação de produtos de reação de montagem de etapa única não é necessária. A execução dessas etapas em grande escala leva várias horas. Salvo indicação em contrário, manter os reagentes e as reações no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Transforme produtos de reação de montagem de etapa única em E. coli em larga escala.<ol><li>Pré-resfriamento de 10 μL a 4 °C. Pré-resfriamento de tubos de 1,5 mL em um bloco de resfriamento de alumínio no gelo.</li>
		<li>Descongele células competentes de E. coli no gelo por 5 min. Alíquota de 10 μL de células competentes para cada tubo pré-resfriado de 1,5 mL. NOTA: Use células de E. coli competentes disponíveis comercialmente com uma eficiência de transformação de pelo menos 1 x 108 UFC / μg de pUC19 DNA.</li>
		<li>Adicione 1 μL de produto de reação de montagem de etapa única a 10 μL de células competentes, agite suavemente para misturar e coloque no gelo por 30 min.</li>
		<li>Incubar os tubos em banho-maria a 42 °C durante 1 min e, em seguida, refrigerar imediatamente no gelo durante 2 min.</li>
		<li>Adicione 100 μL de meio SOC (pré-aquecido a 37 ° C) em cada tubo à temperatura ambiente e incube em uma incubadora agitada (250 rpm) a 37 ° C por 1 h.</li>
		<li>Aquecer até 37 °C as placas LB que contêm um antibiótico correspondente ao gene de resistência aos antibióticos do módulo UAS. Espalhe as células nas placas e incube a 37 °C durante a noite. NOTA: A execução dessas etapas em grande escala leva várias horas. Salvo indicação em contrário, manter os reagentes e as reações no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Verifique os plasmídeos UAS-cDNA/ORF construídos pelo CRISPRmass<ol><li>Escolha uma única colônia e inocule-a em 4,5 mL de meio líquido LB suplementado com a seleção apropriada de antibióticos correspondentes ao gene de resistência a antibióticos do módulo UAS. Incubar durante a noite a 37 °C agitando a 250 rpm.</li>
		<li>Extraia o DNA do plasmídeo usando um kit de mini-preparação de plasmídeo. Configure uma reação de digestão de restrição de 20 μL da seguinte forma: 300-500 ng/μL de plasmídeo, enzima(s) de restrição apropriada(s), tampão de digestão de restrição e água ultrapura. Incubar as reações a 37 °C durante 1 h.</li>
		<li>Separe os fragmentos de DNA por eletroforese em gel de agarose a 0,8% e analise por um sistema de imagem digital (Figura 3).</li>
	</ol></li>
</ol>

Uma construção de biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF de alto rendimento usando CRISPRmass

<ol>
	<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+eukaryotes.">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li><li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster.">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li><li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function:+insights+from+model+organisms.">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86 (4), 521-529 (1996).</li><li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+Drosophila+melanogaster.">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Bischof, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+platform+for+creating+a+comprehensive+UAS-ORFeome+library+in+Drosophila.">A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila.</a> Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).</li><li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+functional+approach+to+uncover+human+genes+and+pathways+in+Drosophila.">A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila.</a> Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).</li><li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA/ORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans.">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+complementary+DNA+resource.">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).</li><li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gene+collection:+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%+of+D.+melanogaster+genes.">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs.">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As etapas mais críticas do CRISPRmass são o design de sgRNAs e a avaliação de sgRNAs. A seleção de sgRNAs altamente eficientes para Cas9 é a chave para o sucesso do CRISPRmass. Se forem observadas muito poucas ou nenhumas colónias na maioria das placas LB contendo antibióticos após a transformação de E. coli com produtos de montagem de reação de etapa única, verifique a digestão do plasmídeo por eletroforese em gel de agarose. Se os plasmídeos não forem bem digeridos, verifique a atividade de Cas9, a d...

A triagem genética imparcial do genoma completo é uma abordagem poderosa para identificar genes envolvidos em um determinado processo biológico e elucidar seu mecanismo. Portanto, é amplamente utilizado em vários campos da pesquisa biológica. Aproximadamente 60% dos genes de Drosophila são conservados em humanos 1,2 e ~ 75% dos genes de doenças humanas têm homólogos em Drosophila3. A triagem genética é dividida principalmente em dois tipos: perda de função (LOF) e ganho de função (GOF). As telas genéticas LOF em Drosophila desempenharam um papel crítico na elucidação de mecanismos que governam quase todos os aspectos da biologia. No entanto, a maioria dos genes de Drosophila não possui fenótipos LOFóbvios 4 e, portanto, a triagem GOF é um método importante para estudar a função desses genes 4,5.
O sistema binário GAL4 / UAS é comumente usado para expressão gênica específica do tecido em Drosophila6. Nesse sistema, o tecido expressa especificamente o ativador de transcrição de levedura GAL4 que se liga ao elemento responsivo GAL4 (UAS) e, assim, ativa a transcrição dos componentes genéticos a jusante (por exemplo, cDNA e ORF) 6 . Para realizar triagens GOF em todo o genoma em Drosophila, precisamos construir uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em todo o genoma e, posteriormente, uma biblioteca transgênica de UAS-cDNA/ORF em Drosophila.
A construção de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em todo o genoma por métodos convencionais a partir de clones de cDNA/ORF disponíveis publicamente é demorada e trabalhosa, pois cada gene requer projetos individualizados, incluindo design e síntese de primers, reação em cadeia da polimerase (PCR) e purificação em gel, sequenciamento, digestão de restrição e assim por diante 7,8. Portanto, a construção de tal biblioteca de plasmídeos é uma etapa limitante da taxa na criação de uma biblioteca transgênica UAS-cDNA / ORF em todo o genoma em Drosophila. Recentemente, resolvemos com sucesso esse problema desenvolvendo um novo método, a montagem modular baseada em CRISPR (CRISPRmass)9. O núcleo do CRISPRmass é manipular as sequências vetoriais compartilhadas de uma biblioteca de plasmídeos por meio de uma combinação de tecnologia de edição de genes e tecnologia de clonagem contínua.
Aqui, apresentamos um protocolo para CRISPRmass, que inclui reações massivamente paralelas em tubos de ensaio de duas etapas seguidas de transformação bacteriana. O CRISPRmass é um método simples, rápido, eficiente e econômico que, em princípio, pode ser usado para a construção de alto rendimento de várias bibliotecas de plasmídeos.
Estratégia CRISPRmass O procedimento de CRISPRmass começa com reações paralelas em tubo de ensaio de duas etapas antes da transformação de Escherichia coli (E. coli) (Figura 1). A etapa 1 é a clivagem dos esqueletos vetoriais idênticos dos plasmídeos cDNA / ORF por Cas9 / sgRNA. Um local de clivagem ideal é adjacente à extremidade 5 'do cDNA / ORF. Os produtos de clivagem não precisam ser purificados. A etapa 2 é a inserção de um módulo UAS específico do vetor nos plasmídeos linearizados de cDNA/ORF Cas9/sgRNA pela montagem de Gibson (doravante denominada reação de etapa única), resultando em plasmídeos UAS-cDNA/ORF. As sequências terminais 5 'e 3' de um módulo UAS se sobrepõem às dos plasmídeos cDNA / ORF linearizados, permitindo a reação de etapa única.
Os produtos de reação de etapa única são diretamente submetidos à transformação de E. coli . Teoricamente, apenas as colônias UAS-cDNA/ORF desejadas podem crescer em placas Luria-Bertani (LB) que contêm antibióticos de seleção correspondentes ao gene de resistência a antibióticos do módulo UAS. O módulo UAS é composto por um módulo UAS central, um gene de resistência a antibióticos distinto daquele dos plasmídeos cDNA ou ORF e as sequências terminais 5 'e 3'. Um módulo UAS central compreende 10 cópias de UAS, um promotor mínimo de Hsp70, uma sequência attB para integração genômica mediada por phiC31 e um marcador de transformação mini-branco para Drosophila7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum Cooling Block</td>
			<td>Aikbbio</td>
			<td>ADMK-0296</td>
			<td>To perform bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D2500</td>
			<td>To purify DNA from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>2500B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D6943</td>
			<td>To isolate plasmid DNA from bacterial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>Shanghai Zhichu&#160;</td>
			<td>ZQLY-180V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T series Multi-Block Thermal Cycler</td>
			<td>LongGene</td>
			<td>T20</td>
			<td>To perform PCR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans10 Chemically Competent Cell</td>
			<td>TranGen BioTech</td>
			<td>CD101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>BioSpec-nano</td>
			<td>To measure concentration of DNA or RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-based modular assembly for high-throughput construction of a uas-cdna/orf plasmid library

A triagem genômica funcional oferece uma abordagem poderosa para investigar a função do gene e depende da construção de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma. As abordagens convencionais para a construção de bibliotecas de plasmídeos são demoradas e trabalhosas. Portanto, desenvolvemos recentemente um método simples e eficiente, montagem modular baseada em CRISPR (CRISPRmass), para construção de alto rendimento de uma biblioteca de plasmídeos de DNA complementar de sequência de ativação upstream / quadro de leitura aberto (UAS-cDNA / ORF) em todo o genoma. Aqui, apresentamos um protocolo para CRISPRmass, tomando como exemplo a construção de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF baseada em GAL4/UAS. O protocolo inclui reações massivamente paralelas em tubos de ensaio de duas etapas, seguidas de transformação bacteriana. O primeiro passo é linearizar os plasmídeos de biblioteca de cDNA ou ORF de DNA complementar (cDNA) ou quadro de leitura aberta (ORF) existentes, cortando as sequências vetoriais upstream compartilhadas adjacentes à extremidade 5 'de cDNAs ou ORFs usando CRISPR / Cas9 junto com RNA guia único (sgRNA), e o segundo passo é inserir um módulo UAS nos plasmídeos linearizados de cDNA ou ORF usando uma reação de etapa única. O CRISPRmass permite a construção simples, rápida, eficiente e econômica de várias bibliotecas de plasmídeos. A biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF pode ser utilizada para triagem de ganho de função em células cultivadas e para construir uma biblioteca transgênica UAS-cDNA/ORF em todo o genoma em Drosophila.

Unbiased whole-genome genetic screening is a powerful approach for identifying genes involved in a given biological process and elucidating its mechanism. Therefore, it is widely used in various fields of biological research. Approximately 60% of Drosophila genes are conserved in humans1,2, and ~75% of human disease genes have homologs in Drosophila3. Genetic screening is mainly divided into two types: loss of function (LOF) and gain of function (GOF). LOF genetic screens in Drosophila have played a critical role in elucidating mechanisms that govern nearly every aspect of biology. However, the majority of Drosophila genes do not have obvious LOF phenotypes4, and therefore, GOF screening is an important method for studying the function of those genes4,5.
The binary GAL4/UAS system is commonly used for tissue-specific gene expression in Drosophila6. In this system, the tissue specifically expresses yeast transcription activator GAL4 that binds to the GAL4 responsive element (UAS) and thereby activates transcription of the downstream genetic components (e.g., cDNA and ORF)6. To perform genome-wide GOF screens in Drosophila, we need to construct a genome-wide UAS-cDNA/ORF plasmid library and, subsequently, a transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila.
Construction of a genome-wide UAS-cDNA/ORF plasmid library by conventional methods from publicly available cDNA/ORF clones is time-consuming and laborious, as every gene requires individualized designs, including primer design and synthesis, polymerase chain reaction (PCR), and gel purification, sequencing, restriction digestion, and so on7,8. Therefore, the construction of such a plasmid library is a rate-limiting step in creating a genome-wide transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila. Recently, we successfully solved this problem by developing a novel method, CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass)9. The core of CRISPRmass is to manipulate the shared vector sequences of a plasmid library through a combination of gene editing technology and seamless cloning technology.
Here, we present a protocol for CRISPRmass, which includes massively parallel two-step test tube reactions followed by bacterial transformation. CRISPRmass is a simple, fast, efficient, and cost-effective method that, in principle, can be used for high-throughput construction of various plasmid libraries.
CRISPRmass strategy 
The procedure of CRISPRmass starts with parallel two-step test tube reactions prior to Escherichia coli (E. coli) transformation (Figure 1). Step 1 is the cleavage of the identical vector backbones of the cDNA/ORF plasmids by Cas9/sgRNA. An ideal cleavage site is adjacent to the 5&#8242; end of cDNA/ORF. The cleavage products do not have to be purified. Step 2 is the insertion of a vector-specific UAS module into the Cas9/sgRNA linearized cDNA/ORF plasmids by Gibson assembly (hereafter referred to as single step reaction), resulting in UAS-cDNA/ORF plasmids. The 5&#8242; and 3&#8242; terminal sequences of a UAS module overlap with those of the linearized cDNA/ORF plasmids, enabling the single step reaction.
The single step reaction products are directly subjected to E. coli transformation. Theoretically, only the desired UAS-cDNA/ORF colonies can grow on Luria-Bertani (LB) plates that contain selection antibiotics corresponding to the antibiotic resistance gene of the UAS module. The UAS module is composed of a core UAS module, an antibiotic resistance gene distinct from that of cDNA or ORF plasmids, and the 5&#8242; and 3&#8242; terminal sequences. A core UAS module comprises 10 copies of UAS, an Hsp70 minimal promoter, an attB sequence for phiC31-mediated genomic integration, and a mini-white transformation marker for Drosophila7.

Autor em destaque: simplificando a construção da biblioteca de plasmídeos em todo o genoma usando CRISPRmass

Montagem modular baseada em CRISPR para construção de alto rendimento de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF

Functional genomic screening offers a powerful approach to probe gene function, and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. Conventional approaches for plasmid library construction are time-consuming and laborious. To address this question, we develop a simple and efficient method, CRISPR-based modular assembly, or CRISPRmass.Through cleavage of shared vector sequences of cDNA or ORF plasmid by CRISPR/Cas9 and subsequent insertion of UAS modules by adjacent assembly, the procedure of construction of a genome-wide plasmid library by CRISPRmass is standardized as massively parallel two-step test tube reactions before bacterial transformation. CRISPRmass allows the simple, fast, efficient, and cost-effective construction of various plasmid libraries. It can also be applied to editing various genome-wide plasmid libraries in general, and it's an alternative to gateway technology in high-throughput plasmid library editing, paving the way for the global studies of biological networks.

Aplicamos o CRISPRmass para gerar uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em todo o genoma usando 3402 clones de cDNA/ORF com esqueleto vetorial pOT2 da DGRC Gold Collection. Analisamos aleatoriamente apenas uma colônia para cada construção UAS-cDNA/ORF, e a análise de restrição subsequente com PstI indicou que 98,6% das construções UAS-cDNA/ORF foram criadas com sucesso9. A justificativa para o uso de PstI para análise de restrição de construções UAS-cDNA/ORF com estrutura vetoria...

Apresentamos um protocolo para montagem modular baseada em CRISPR (CRISPRmass), um método para construção de alto rendimento da biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em Drosophila usando recursos de cDNA/ORF disponíveis publicamente. O CRISPRmass pode ser aplicado à edição de várias bibliotecas de plasmídeos.

Functional genomics screening offers a powerful approach to probe gene function and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. ...

A triagem genômica funcional oferece uma abordagem poderosa para sondar a função do gene e depende da construção de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma. As abordagens convencionais para a construção de bibliotecas de plasmídeos são demoradas e trabalhosas. Para resolver essa questão, desenvolvemos um método simples e eficiente, a montagem modular baseada em CRISPR, ou CRISPRmass.Por meio da clivagem de sequências vetoriais compartilhadas de cDNA ou plasmídeo ORF por CRISPR/Cas9 e subsequente inserção de módulos UAS por montagem adjacente, o procedimento de construção de uma biblioteca de plasmídeos em todo o genoma por CRISPRmass é padronizado como reações massivamente paralelas de tubo de ensaio de duas etapas antes da transformação bacteriana. O CRISPRmass permite a construção simples, rápida, eficiente e econômica de várias bibliotecas de plasmídeos. Também pode ser aplicado à edição de várias bibliotecas de plasmídeos de todo o genoma em geral, e é uma alternativa à tecnologia de gateway na edição de bibliotecas de plasmídeos de alto rendimento, abrindo caminho para os estudos globais de redes biológicas.

crispr-based-modular-assembly-for-high-throughput-construction-uas

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR-Based Modular Assembly for High-Throughput Construction of a UAS-cDNA/ORF Plasmid Library

495 visualizações.  University of South China. A triagem genômica funcional oferece uma abordagem poderosa para sondar a função do gene e depende da construção de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma. As abordagens convencionais para a construção de bibliotecas de plasmídeos são demoradas e trabalhosas. Para resolver essa questão, desenvolvemos um método simples e eficiente, a montagem modular baseada em CRISPR, ou CRISPRmass.Por meio da clivagem de sequências vetoriais compartilhadas de cDNA ou plasmídeo ORF po...