המחקר שלנו התמקד בפיתוח מתודולוגיה פשוטה שלב אחר שלב להכנת שקופיות היסטולוגיות והערכת רשתית המכרסם. תוצאות בדיקה היסטולוגית של הרשתית יכולות לשמש למחקר על רבות ממחלות עיניים, כולל מחלות נוירודגנרטיביות וכלי דם. בספרות שפורסמה, תיאור המתודולוגיה לבדיקה היסטולוגית של גלגלי עיניים של מכרסמים מוגבל מאוד.
מדריכים שלב אחר שלב חסרים, מה שמקשה על מתחילים לשחזר. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור חוקרים אחרים. למרות שישנן שיטות אחרות שניתן להשתמש בהן כדי להעריך את המורפולוגיה של הרשתית, כולל טומוגרפיה קוהרנטית אופטית, הבדיקה ההיסטופתולוגית מאפשרת הערכה של תאים בודדים ומספקת פחות ממצאים.
לכן, זה יכול להוכיח להיות שימושי יותר לחקר פתומנגנונים של מחלות עיניים. כדי להתחיל, הסר את גלגלי העיניים של החולדה הקבועה בסוכרוז מהמקפיא. חותכים את גלגל העין לשניים לאורך מישור הקשת עם אזמל חד.
לאחר מכן הסר והשלך את העדשה. הפשירו את גלגל העין בטמפרטורת החדר. מעבירים את שני החצאים לקלטת, ושוטפים תחת מים זורמים במשך 20 דקות כדי לשטוף את הסוכרוז.
יש לייבש את גלגל העין בריכוז אתנול מוגבר למשך 15 דקות כל אחת מתחת למכסה אדים, עם התייבשות סופית באצטון למשך שבע דקות. כדי לנקות את גלגל העין, הניחו אותו בקסילן למשך שבע דקות מתחת למכסה אדים. מוסיפים מעט פרפין מוצק לתוך כד, ומניחים אותו באינקובטור המוגדר לטמפרטורה גבוהה יותר מטמפרטורת ההתכה שצוינה על ידי יצרן הפרפין.
לאחר שהפרפין נמס במלואו, העבירו את גלגל העין לתוך הכד והשאירו את הכד באינקובטור למשך שעה. מערבבים את הכד כל 10 עד 15 דקות במהלך הדגירה לחדירת פרפין לרקמה. לאחר מכן, פתח את הקלטת והסר את הכיסוי העליון.
בחרו תבנית מתכת, ושפכו כמות קטנה של פרפין כדי לכסות את תחתית התבנית. לאחר מכן מוציאים את גלגל העין מהקלטת בעזרת מלקחיים, ומניחים חצי גלגל עין אחד עם תחתית הכוס למעלה והשני למטה על הפרפין בתבנית. כאשר הרקמה מעוגנת במקום, מכסים בזהירות את גלגל העין בפרפין ואת תחתית הקלטת כדי ליצור בלוק.
העבירו את הבלוק על צלחת קירור למיצוק מלא. לאחר ההתמצקות, מוציאים את הבלוק מתבנית המתכת ומחזירים את קוביות הפרפין לצלחת הקירור למשך 15 דקות. אבטחו בלוק פרפין במיקרוטום.
מניחים את המיקרוטום כדי לחתוך את הפרפין העודף מהבלוק, וחותכים עד שמגיעים למרכז גלגל העין. לאחר שינוי הגדרות המיקרוטום, חתכו חלקים דקים יותר של 3.5 מיקרומטר. מקם את המקטע הגזור בשקופית.
הכניסו את המגלשה לאינקובטור למשך 15 דקות כדי שהפרפין יימס. לאחר מכן מקם את השקופית בקסילן. לאחר מכן, להעביר את השקופית באתנול 96%.
לאחר הטיפול באתנול, שטפו את המגלשה במים זורמים במשך חמש דקות. מניחים את המגלשה למשך שתי דקות בהמטוקסילין של מאייר ולאחר מכן שתי דקות בהמטוקסילין של מאייר עם תמיסה נקייה. שטפו את המגלשה פעמיים במים זורמים במשך חמש דקות כל אחת.
הוסיפו 1% אאוסין למשך שתי דקות, ולאחר מכן אתנול למשך דקה ו-30 שניות כל אחת. שים את המגלשה במשך שתי דקות ב xylene, ואחריו דקה אחת xylene עם נוספת עם פתרון נקי. אטם את המגלשה באמצעות אוטם שקופיות אוטומטי.
כדי להתחיל, במחשב, פתח את תמונת גלגל העין של החולדה הסרוקה ברזולוציה גבוהה ומצא את חתכי האישון הצולבים. הגדל את חתך הרוחב שנבחר על-ידי גלילה באמצעות העכבר. לאחר מכן סובבו את הנקודה בפינה הימנית כדי להתאים את כיוון התמונה כך שהרשתית תהיה אופקית.
לחץ על תיבת ההגדלה בפינה השמאלית העליונה ובחר 20 פעמים כדי למצוא את החלק העבה ביותר של הרשתית. לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על העכבר כדי לבחור הוסף ביאורים וסרגל. מקם את סמן העכבר בקרום המגביל החיצוני בחלק העבה ביותר של הרשתית, ולחץ על הלחצן השמאלי כדי להתחיל את המדידה.
לאחר מכן הזז את הסמן בניצב לקרום המגביל הפנימי ולחץ שוב על הלחצן השמאלי כדי להשלים את המדידה. תן כותרת למדידה כעובי רשתית, וסמן את התיבות כדי להציג את הכותרת והאורך. לאחר מכן, באמצעות סרגל, למדוד את העובי של כל שכבת רשתית, כולל השכבה הגרעינית החיצונית, שכבת הפרספקס החיצונית, השכבה הגרעינית הפנימית ושכבת הפרספקס הפנימית, ולתייג אותם בהתאם.
כדי לספור את מספר התאים בתוך שכבת תאי הגנגליון, בחר קטע אחד של הרשתית, ובאמצעות הסרגל מדוד את המרחק שנבחר לאורך שכבת תאי הגנגליון. כדי לסמן את גופי התא, לחץ על הלחצן הימני בעכבר ובחר הוסף ביאורים, שמור ו- 1 x RBC. לחץ על כל תא המזוהה כגוף עגול ומוכתם בהמטין לאורך שכבת תאי הגנגליון לאורך האורך שנקבע מראש של הרשתית.
ספירת מספר התאים המוקפים, עובי הרשתית, עובי השכבות הבודדות ומספר התאים בשכבת תאי הגנגליון נמדדו והושוו בין אנשים כדי להעריך את תכונות הניוון העצבי ברשתית המכרסם.
