Notre recherche s’est concentrée sur le développement d’une méthodologie simple, étape par étape, pour la préparation des lames histologiques et l’évaluation de la rétine des rongeurs. Les résultats d’un examen histologique de la rétine peuvent être utilisés pour la recherche sur de nombreuses maladies ophtalmiques, y compris les troubles neurodégénératifs et vasculaires. Dans la littérature publiée, la description de la méthodologie d’examen histologique des globes oculaires de rongeurs est très limitée.
Les guides étape par étape font défaut, ce qui rend difficile la recréation pour les débutants. Nous pensons que ce protocole sera utile à d’autres chercheurs. Même s’il existe d’autres méthodes qui peuvent être utilisées pour évaluer la morphologie de la rétine, y compris la tomographie par cohérence optique, l’examen histopathologique permet d’évaluer des cellules uniques et fournit moins d’artefacts.
Ainsi, il peut s’avérer plus utile pour la recherche sur les mécanismes pathologiques des maladies ophtalmiques. Pour commencer, retirez le paraformaldéhyde et les globes oculaires de rat fixés au saccharose du congélateur. Coupez le globe oculaire en deux le long du plan sagittal avec un scalpel bien aiguisé.
Retirez et jetez ensuite l’objectif. Décongelez le globe oculaire à température ambiante. Déplacez les deux moitiés dans une cassette et rincez à l’eau courante pendant 20 minutes pour éliminer le saccharose.
Déshydratez le globe oculaire en augmentant la concentration d’éthanol pendant 15 minutes chacune sous une hotte, avec déshydratation finale à l’acétone pendant sept minutes. Pour dégager le globe oculaire, placez-le dans du xylène pendant sept minutes sous une hotte. Ajoutez de la paraffine solide dans un bécher et placez-la dans un incubateur réglé à une température supérieure à la température de fusion spécifiée par le fabricant de paraffine.
Une fois que la paraffine est complètement fondue, déplacez le globe oculaire dans le bécher et laissez le bécher dans l’incubateur pendant une heure. Remuez le bécher toutes les 10 à 15 minutes pendant l’incubation pour l’infiltration de la paraffine dans les tissus. Ensuite, ouvrez la cassette et retirez le capot supérieur.
Choisissez un moule en métal et versez une petite quantité de paraffine pour couvrir le fond du moule. Retirez ensuite le globe oculaire de la cassette à l’aide d’une pince et placez une moitié du globe oculaire avec le fond de la tasse vers le haut et l’autre vers le bas sur la paraffine dans le moule. Lorsque le tissu est ancré en place, couvrez soigneusement le globe oculaire avec de la paraffine et le fond de la cassette pour former un bloc.
Transférez le bloc sur une plaque de refroidissement pour qu’il se solidifie complètement. Après solidification, retirez le bloc du moule métallique et replacez les blocs de paraffine sur la plaque de refroidissement pendant 15 minutes. Fixez un bloc de paraffine dans le microtome.
Réglez le microtome pour couper l’excès de paraffine du bloc et coupez jusqu’à ce que le centre du globe oculaire soit atteint. Après avoir modifié les paramètres du microtome, coupez des sections plus fines de 3,5 micromètres. Placez la section coupée sur une diapositive.
Mettez la lame dans un incubateur pendant 15 minutes pour que la paraffine fonde. Placez ensuite la lame dans du xylène. Ensuite, transférez la lame dans de l’éthanol à 96 %.
Après le traitement à l’éthanol, lavez la lame à l’eau courante pendant cinq minutes. Placez la lame pendant deux minutes dans de l’hématoxyline de Mayer, puis deux minutes dans de l’hématoxyline de Mayer avec une solution propre. Lavez la lame deux fois à l’eau courante pendant cinq minutes chacune.
Ajoutez 1 % d’éosine pendant deux minutes, puis de l’éthanol pendant une minute et 30 secondes chacun. Mettez la lame pendant deux minutes dans du xylène, suivie d’une minute de xylène avec un autre bécher avec une solution propre. Scellez la diapositive à l’aide d’une scelleuse de lames automatisée.
Pour commencer, sur un ordinateur, ouvrez l’image haute résolution numérisée du globe oculaire de rat et trouvez les sections transversales de la pupille. Agrandissez la section sélectionnée en la faisant défiler avec la souris. Ensuite, faites pivoter le point dans le coin droit pour ajuster l’orientation de l’image afin que la rétine soit horizontale.
Cliquez sur la case de grossissement dans le coin supérieur droit et sélectionnez 20 fois pour trouver la partie la plus épaisse de la rétine. Ensuite, faites un clic droit sur la souris pour choisir Annoter et Règle. Positionnez le curseur de la souris sur la membrane limitante externe dans la partie la plus épaisse de la rétine et cliquez sur le bouton gauche pour commencer la mesure.
Déplacez ensuite le curseur perpendiculairement à la membrane de limitation interne, puis cliquez à nouveau sur le bouton gauche pour terminer la mesure. Attribuez à la mesure l’expression Épaisseur rétinienne et cochez les cases pour afficher le titre et la longueur. Ensuite, à l’aide d’une règle, mesurez l’épaisseur de chaque couche rétinienne, y compris la couche nucléaire externe, la couche plexiforme externe, la couche nucléaire interne et la couche plexiforme interne, et étiquetez-les en conséquence.
Pour compter le nombre de cellules dans la couche de cellules ganglionnaires, sélectionnez une section de la rétine et, à l’aide de la règle, mesurez la distance choisie le long de la couche de cellules ganglionnaires. Pour marquer les corps de cellule, appuyez sur le bouton droit de la souris et sélectionnez Annoter, Enregistrer et 1 x RBC. Cliquez sur chaque cellule identifiée comme un corps rond, nucléé et coloré à l’hématine le long de la couche de cellules ganglionnaires sur la longueur prédéterminée de la rétine.
L’épaisseur de la rétine, l’épaisseur des couches individuelles et le nombre de cellules dans la couche de cellules ganglionnaires ont été mesurés et comparés entre les individus pour évaluer les caractéristiques de la neurodégénérescence dans la rétine des rongeurs.
