우리의 연구는 조직학적 슬라이드를 준비하고 설치류 망막을 평가하기 위한 간단한 단계별 방법론을 개발하는 데 중점을 두었습니다. 망막의 조직학적 검사 결과는 신경 퇴행성 및 혈관 질환을 포함한 많은 안과 질환에 대한 연구에 사용될 수 있습니다. 발표된 문헌에서 설치류 안구의 조직학적 검사 방법론에 대한 설명은 매우 제한적입니다.
단계별 가이드가 부족하여 초보자가 다시 만들기가 어렵습니다. 우리는 이 프로토콜이 다른 연구자들에게 유용할 것이라고 믿습니다. 광간섭 단층촬영(optical coherence tomography)을 포함하여 망막의 형태를 평가하는 데 사용할 수 있는 다른 방법이 있지만, 조직병리학적 검사는 단일 세포를 평가할 수 있고 더 적은 인공물을 제공합니다.
따라서 안과 질환의 병리 메커니즘을 연구하는 데 더 유용할 수 있습니다. 시작하려면 냉동실에서 파라포름알데히드와 자당으로 고정된 쥐 안구를 꺼냅니다. 날카로운 메스로 시상면을 따라 안구를 반으로 자릅니다.
그런 다음 렌즈를 제거하고 폐기하십시오. 안구는 실온에서 해동합니다. 두 개의 반쪽을 카세트로 옮기고 흐르는 물에 20분 동안 헹구어 자당을 씻어냅니다.
흄 후드 아래에서 각각 15분 동안 에탄올 농도를 증가시켜 안구를 탈수하고 7분 동안 아세톤에서 최종 탈수를 수행합니다. 안구를 깨끗이 닦으려면 흄 후드 아래 자일렌에 7분 동안 두십시오. 비커에 고체 파라핀을 약간 넣고 파라핀 제조업체에서 지정한 용융 온도보다 높은 온도로 설정된 인큐베이터에 넣습니다.
파라핀이 완전히 녹은 후 안구를 비커로 옮기고 비커를 인큐베이터에 1시간 동안 그대로 둡니다. 파라핀이 조직으로 침투하기 위해 배양 중 10-15분마다 비커를 저어줍니다. 그런 다음 카세트를 열고 상단 커버를 제거합니다.
금속 주형을 선택하고 금형 바닥을 덮기 위해 소량의 파라핀을 붓습니다. 그런 다음 집게로 카세트에서 안구를 제거하고 한쪽 안구를 컵 바닥이 위로 향하게, 다른 안구를 아래로 하여 틀의 파라핀 위에 놓습니다. 조직이 제자리에 고정되면 안구를 파라핀으로 조심스럽게 덮고 카세트 바닥을 덮어 블록을 형성합니다.
완전히 응고되도록 냉각판에 블록을 옮깁니다. 응고 후 금형에서 블록을 제거하고 파라핀 블록을 15분 동안 냉각판에 다시 놓습니다. 마이크로톰에 파라핀 블록을 고정합니다.
마이크로톰을 설정하여 블록에서 여분의 파라핀을 제거하고 안구 중심에 도달할 때까지 다듬습니다. 마이크로톰 설정을 변경한 후 3.5마이크로미터의 더 얇은 부분을 자릅니다. 절단된 부분을 슬라이드에 놓습니다.
파라핀이 녹을 때까지 슬라이드를 인큐베이터에 15분 동안 넣습니다. 그런 다음 슬라이드를 자일렌에 놓습니다. 그런 다음 슬라이드를 96% 에탄올로 옮깁니다.
에탄올 처리 후 슬라이드를 흐르는 물에 5분 동안 세척합니다. 슬라이드를 Mayer의 헤마톡실린에 2분 동안 넣은 다음 깨끗한 용액과 함께 Mayer의 헤마톡실린에 2분 동안 놓습니다. 슬라이드를 흐르는 물에 각각 5분씩 두 번 씻습니다.
1%eosin을 2분 동안 첨가한 다음 에탄올을 각각 1분 30초 동안 첨가합니다. 슬라이드를 자일렌에 2분 동안 넣은 다음 깨끗한 용액이 담긴 다른 비커로 1분 동안 자일렌을 넣습니다. 자동 슬라이드 실러를 사용하여 슬라이드를 밀봉합니다.
먼저 컴퓨터에서 고해상도로 스캔된 쥐 안구 이미지를 열고 교차 동공 단면을 찾습니다. 마우스로 스크롤하여 선택한 횡단면을 확대합니다. 그런 다음 오른쪽 모서리에 있는 점을 회전하여 망막이 수평이 되도록 이미지 방향을 조정합니다.
오른쪽 상단 모서리에 있는 확대 상자를 클릭하고 20번 선택하여 망막의 가장 두꺼운 부분을 찾습니다. 그런 다음 마우스를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 Annotate(주석) 및 Ruler(눈금자)를 선택합니다. 마우스 커서를 망막의 가장 두꺼운 부분에 있는 외부 제한 멤브레인에 놓고 왼쪽 버튼을 클릭하여 측정을 시작합니다.
그런 다음 커서를 내부 제한 멤브레인에 수직으로 이동하고 왼쪽 버튼을 다시 클릭하여 측정을 완료합니다. 측정 제목을 Retinal thickness로 지정하고 상자를 선택하여 제목과 길이를 표시합니다. 다음으로, 자를 사용하여 외부 핵층, 외부 망상층, 내부 핵층 및 내부 망상층을 포함한 각 망막층의 두께를 측정하고 그에 따라 레이블을 지정합니다.
신경절 세포층 내의 세포 수를 세려면, 망막의 한 부분을 선택하고, 자를 사용하여 신경절 세포층을 따라 선택한 거리를 측정합니다. 세포체를 표시하려면 마우스의 오른쪽 버튼을 누르고 주석, 저장됨 및 1 x RBC를 선택합니다. 미리 결정된 길이의 망막에 걸쳐 신경절 세포층을 따라 둥글고 핵이 있는 헤마틴으로 염색된 몸체로 식별된 각 세포를 클릭합니다.
둘러싸인 세포의 수를 세고, 망막 두께, 개별 층의 두께, 신경절 세포층의 세포 수를 측정하고 개인별로 비교하여 설치류 망막의 신경 퇴행 특징을 평가했습니다.
