Araştırmamız, histolojik slaytlar hazırlamak ve kemirgen retinasını değerlendirmek için basit bir adım adım metodoloji geliştirmeye odaklandı. Retinanın histolojik incelemesinin sonuçları, nörodejeneratif ve vasküler bozukluklar da dahil olmak üzere birçok oftalmik hastalık üzerinde araştırma yapmak için kullanılabilir. Yayınlanmış literatürde, kemirgen gözbebeklerinin histolojik muayenesi için metodolojinin tanımı çok sınırlıdır.
Adım adım kılavuzlar eksiktir, bu da yeni başlayanların yeniden oluşturmasını zorlaştırır. Bu protokolün diğer araştırmacılar için de faydalı olacağına inanıyoruz. Optik koherens tomografi de dahil olmak üzere retinanın morfolojisini değerlendirmek için kullanılabilecek başka yöntemler olsa da, histopatolojik inceleme tek hücrelerin değerlendirilmesine izin verir ve daha az artefakt sağlar.
Bu nedenle, oftalmik hastalıkların patomekanizmalarını araştırmak için daha yararlı olduğu kanıtlanabilir. Başlamak için, paraformaldehit ve sakarozla sabitlenmiş sıçan gözbebeklerini dondurucudan çıkarın. Keskin bir neşter ile göz küresini sagital düzlem boyunca ikiye bölün.
Ardından lensi çıkarın ve atın. Göz küresini oda sıcaklığında çözdürün. İki yarıyı bir kasete aktarın ve sakarozları yıkamak için akan su altında 20 dakika durulayın.
Göz küresini, her biri bir davlumbaz altında 15 dakika boyunca artan etanol konsantrasyonunda kurutun, son dehidrasyon asetonda yedi dakika boyunca dehidrasyon ile birlikte. Göz küresini temizlemek için, bir davlumbazın altında yedi dakika boyunca ksilen içine yerleştirin. Bir behere biraz katı parafin ekleyin ve parafin üreticisi tarafından belirtilen erime sıcaklığından daha yüksek bir sıcaklığa ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin.
Parafin tamamen eridikten sonra, göz küresini behere doğru hareket ettirin ve beheri bir saat boyunca inkübatörde bırakın. Dokuya parafin sızması için inkübasyon sırasında beheri her 10 ila 15 dakikada bir karıştırın. Ardından, kaseti açın ve üst kapağı çıkarın.
Metal bir kalıp seçin ve kalıbın altını kaplamak için az miktarda parafin dökün. Daha sonra göz küresini forseps ile kasetten çıkarın ve bir göz küresinin yarısını bardağın dibi yukarı ve diğer kısmını kalıptaki parafinin üzerine yerleştirin. Doku yerine sabitlendiğinde, bir blok oluşturmak için göz küresini parafin ve kaset tabanını dikkatlice kapatın.
Tamamen katılaşması için bloğu bir soğutma plakasına aktarın. Katılaşmadan sonra, bloğu metal kalıptan çıkarın ve parafin bloklarını 15 dakika boyunca soğutma plakasına geri yerleştirin. Mikrotomda bir parafin bloğu sabitleyin.
Bloktaki fazla parafini kesmek için mikrotomu ayarlayın ve göz küresinin merkezine ulaşılana kadar kesin. Mikrotom ayarlarını değiştirdikten sonra 3,5 mikrometrelik daha ince kesitler kesin. Kesilen bölümü bir slaytın üzerine yerleştirin.
Parafinin erimesi için slaytı 15 dakika boyunca bir kuluçka makinesine koyun. Ardından slaydı ksilenin içine yerleştirin. Bunu takiben, slaytı% 96 etanol içinde aktarın.
Etanol işleminden sonra, slaytı beş dakika boyunca akan suda yıkayın. Slaytı iki dakika boyunca Mayer'in hematoksilinine yerleştirin, ardından iki dakika Mayer'in hematoksilinine temiz bir çözelti ile yerleştirin. Slaytı iki kez, her biri beş dakika boyunca akan suyla yıkayın.
İki dakika boyunca% 1 eozin, ardından her biri bir dakika ve 30 saniye boyunca etanol ekleyin. Slaytı iki dakika boyunca ksilen içine koyun, ardından temiz bir çözelti ile başka bir beher ile bir dakika ksilen koyun. Otomatik bir slayt kapatıcı kullanarak slaydı kapatın.
Başlamak için, bir bilgisayarda, yüksek çözünürlüklü taranmış sıçan göz küresi görüntüsünü açın ve çapraz göz bebeği kesitlerini bulun. Fare ile kaydırarak seçilen kesiti büyütün. Ardından, görüntü yönünü retina yatay olacak şekilde ayarlamak için sağ köşedeki noktayı döndürün.
Retinanın en kalın kısmını bulmak için sağ üst köşedeki büyütme kutusuna tıklayın ve 20 kez seçin. Ardından, Açıklama Ekle ve Cetvel'i seçmek için fareye sağ tıklayın. Fare imlecini retinanın en kalın kısmındaki dış sınırlayıcı zara getirin ve ölçümü başlatmak için sol düğmeye tıklayın.
Ardından imleci iç sınırlayıcı membrana dik olarak hareket ettirin ve ölçümü tamamlamak için sol düğmeye tekrar tıklayın. Ölçümü Retina kalınlığı olarak adlandırın ve başlığı ve uzunluğu göstermek için kutuları işaretleyin. Ardından, bir cetvel kullanarak, dış nükleer katman, dış pleksiform katman, iç nükleer katman ve iç pleksiform katman dahil olmak üzere her retina katmanının kalınlığını ölçün ve buna göre etiketleyin.
Ganglion hücre tabakası içindeki hücre sayısını saymak için, retinanın bir bölümünü seçin ve cetveli kullanarak, ganglion hücre tabakası boyunca seçilen mesafeyi ölçün. Hücre gövdelerini işaretlemek için farenin sağ tuşuna basın ve Açıklama Ekle, Kaydedildi ve 1 x RBC'yi seçin. Retinanın önceden belirlenmiş uzunluğu boyunca ganglion hücre tabakası boyunca yuvarlak, çekirdekli hematin lekeli bir gövde olarak tanımlanan her hücreye tıklayın.
Daire içine alınmış hücrelerin sayısını sayın, Retina kalınlığı, tek tek katmanların kalınlığı ve ganglion hücre katmanındaki hücre sayısı ölçüldü ve kemirgen retinasındaki nörodejenerasyonun özelliklerini değerlendirmek için bireyler arasında karşılaştırıldı.
