Unsere Forschung konzentrierte sich auf die Entwicklung einer einfachen Schritt-für-Schritt-Methode zur Vorbereitung histologischer Objektträger und zur Beurteilung der Netzhaut von Nagetieren. Die Ergebnisse einer histologischen Untersuchung der Netzhaut können für die Erforschung vieler Augenerkrankungen, einschließlich neurodegenerativer und vaskulärer Erkrankungen, genutzt werden. In der publizierten Literatur ist die Methodik für eine histologische Untersuchung von Augäpfeln von Nagetieren nur sehr begrenzt beschrieben.
Es fehlen Schritt-für-Schritt-Anleitungen, was es Anfängern erschwert, sich neu zu erstellen. Wir glauben, dass dieses Protokoll für andere Forscher nützlich sein wird. Auch wenn es andere Methoden gibt, mit denen die Morphologie der Netzhaut beurteilt werden kann, wie z.B. die optische Kohärenztomographie, ermöglicht die histopathologische Untersuchung die Beurteilung einzelner Zellen und liefert weniger Artefakte.
Daher kann es sich als nützlicher für die Erforschung der Pathomechanismen von Augenerkrankungen erweisen. Nehmen Sie zunächst die mit Paraformaldehyd und Saccharose fixierten Rattenaugen aus dem Gefrierschrank. Schneiden Sie den Augapfel mit einem scharfen Skalpell entlang der Sagittalebene in zwei Hälften.
Entfernen Sie dann das Objektiv und entsorgen Sie es. Tauen Sie den Augapfel bei Raumtemperatur auf. Schieben Sie die beiden Hälften in eine Kassette und spülen Sie sie 20 Minuten lang unter fließendem Wasser ab, um die Saccharose auszuwaschen.
Dehydrieren Sie den Augapfel jeweils 15 Minuten lang unter einem Abzug in zunehmender Ethanolkonzentration und dehydrieren Sie ihn schließlich sieben Minuten lang in Aceton. Um den Augapfel zu reinigen, legen Sie ihn sieben Minuten lang in Xylol unter einen Abzug. Geben Sie etwas festes Paraffin in ein Becherglas und geben Sie es in einen Inkubator, der auf eine Temperatur eingestellt ist, die höher ist als die vom Paraffinhersteller angegebene Schmelztemperatur.
Nachdem das Paraffin vollständig geschmolzen ist, schieben Sie den Augapfel in das Becherglas und lassen Sie das Becherglas eine Stunde lang im Inkubator. Rühren Sie den Becher während der Inkubation alle 10 bis 15 Minuten um, damit Paraffin in das Gewebe infiltriert. Öffnen Sie anschließend die Kassette und entfernen Sie die obere Abdeckung.
Wähle eine Metallform und gieße eine kleine Menge Paraffin hinein, um den Boden der Form zu bedecken. Nehmen Sie dann den Augapfel mit einer Pinzette aus der Kassette und legen Sie eine Augapfelhälfte mit dem Boden des Bechers nach oben und die andere nach unten auf das Paraffin in der Form. Wenn das Gewebe verankert ist, bedecken Sie den Augapfel vorsichtig mit Paraffin und den Kassettenboden, um einen Block zu bilden.
Übertragen Sie den Block auf eine Kühlplatte, damit er vollständig erstarrt. Nach dem Erstarren den Block aus der Metallform nehmen und die Paraffinblöcke für 15 Minuten wieder auf die Kühlplatte legen. Befestigen Sie einen Paraffinblock im Mikrotom.
Stellen Sie das Mikrotom so ein, dass das überschüssige Paraffin vom Block abgeschnitten wird, und trimmen Sie, bis die Mitte des Augapfels erreicht ist. Schneiden Sie nach dem Ändern der Mikrotomeinstellungen dünnere Abschnitte von 3,5 Mikrometern ab. Legen Sie den geschnittenen Abschnitt auf eine Folie.
Legen Sie den Objektträger für 15 Minuten in einen Inkubator, damit das Paraffin schmilzt. Legen Sie dann den Objektträger in Xylol. Übertragen Sie anschließend den Objektträger in 96% Ethanol.
Waschen Sie die Rutsche nach der Ethanolbehandlung fünf Minuten lang unter fließendem Wasser. Legen Sie den Objektträger für zwei Minuten in Mayer's Hämatoxylin, gefolgt von zwei Minuten in Mayer's Hämatoxylin mit einer sauberen Lösung. Waschen Sie die Rutsche zweimal jeweils fünf Minuten lang unter fließendem Wasser.
Fügen Sie 1%Eosin für zwei Minuten hinzu, gefolgt von Ethanol für jeweils eine Minute und 30 Sekunden. Legen Sie den Objektträger zwei Minuten lang in Xylol, gefolgt von einer Minute Xylol mit einem anderen Becherglas mit einer sauberen Lösung. Versiegeln Sie den Objektträger mit einem automatischen Objektträgerversiegelungsgerät.
Öffnen Sie zunächst auf einem Computer das hochauflösend gescannte Bild des Rattenaugapfels und suchen Sie die Querschnitte der Pupillen. Vergrößern Sie den markierten Querschnitt, indem Sie mit der Maus scrollen. Drehen Sie dann den Punkt in der rechten Ecke, um die Bildausrichtung so anzupassen, dass die Netzhaut horizontal ist.
Klicken Sie auf das Vergrößerungsfeld in der oberen rechten Ecke und wählen Sie 20 Mal aus, um die dickste Stelle der Netzhaut zu finden. Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste auf die Maus, um Anmerkungen und Lineal auszuwählen. Positionieren Sie den Mauszeiger auf der äußeren Grenzmembran an der dicksten Stelle der Netzhaut und klicken Sie mit der linken Taste, um die Messung zu starten.
Bewegen Sie dann den Cursor senkrecht auf die interne Grenzmembran und klicken Sie erneut auf die linke Taste, um die Messung abzuschließen. Betiteln Sie die Messung mit Netzhautdicke und aktivieren Sie die Kästchen, um den Titel und die Länge anzuzeigen. Messen Sie anschließend mit einem Lineal die Dicke jeder Netzhautschicht, einschließlich der äußeren Kernschicht, der äußeren plexiformen Schicht, der inneren Kernschicht und der inneren plexiformen Schicht, und beschriften Sie sie entsprechend.
Um die Anzahl der Zellen innerhalb der Ganglienzellschicht zu zählen, wählen Sie einen Abschnitt der Netzhaut aus und messen Sie mit dem Lineal den gewählten Abstand entlang der Ganglienzellschicht. Um die Zellkörper zu markieren, drücken Sie die rechte Maustaste und wählen Sie Beschriftung, Gespeichert und 1 x RBC. Klicken Sie auf jede Zelle, die als runder, kernhaltiger, hämatingefärbter Körper entlang der Ganglienzellschicht über die vorgegebene Länge der Netzhaut identifiziert wurde.
Zählen Sie die Anzahl der eingekreisten Zellen, Die Netzhautdicke, die Dicke der einzelnen Schichten und die Anzahl der Zellen in der Ganglienzellschicht wurden gemessen und zwischen Individuen verglichen, um die Merkmale der Neurodegeneration in der Netzhaut der Nagetiere zu beurteilen.
