La nostra ricerca si è concentrata sullo sviluppo di una semplice metodologia passo-passo per la preparazione di vetrini istologici e la valutazione della retina del roditore. I risultati di un esame istologico della retina possono essere utilizzati per la ricerca su molte malattie oftalmiche, comprese le malattie neurodegenerative e vascolari. Nella letteratura pubblicata, la descrizione della metodologia per un esame istologico dei bulbi oculari dei roditori è molto limitata.
Mancano guide passo passo, il che rende difficile per i principianti ricreare. Crediamo che questo protocollo sarà utile per altri ricercatori. Anche se esistono altri metodi che possono essere utilizzati per valutare la morfologia della retina, tra cui la tomografia a coerenza ottica, l'esame istopatologico consente la valutazione di singole cellule e fornisce meno artefatti.
Pertanto, può rivelarsi più utile per la ricerca sui meccanismi patologici delle malattie oftalmiche. Per iniziare, rimuovi dal congelatore la paraformaldeide e i bulbi oculari di ratto fissati con saccarosio. Taglia il bulbo oculare a metà lungo il piano sagittale con un bisturi affilato.
Quindi rimuovere ed eliminare l'obiettivo. Scongelare il bulbo oculare a temperatura ambiente. Spostare le due metà in una cassetta e sciacquare sotto l'acqua corrente per 20 minuti per lavare via il saccarosio.
Disidratare il bulbo oculare in concentrazione crescente di etanolo per 15 minuti ciascuno sotto una cappa aspirante, con disidratazione finale in acetone per sette minuti. Per liberare il bulbo oculare, mettilo nello xilene per sette minuti sotto una cappa aspirante. Aggiungere un po' di paraffina solida in un becher e metterla in un'incubatrice impostata su una temperatura superiore alla temperatura di fusione specificata dal produttore della paraffina.
Dopo che la paraffina è completamente sciolta, spostare il bulbo oculare nel becher e lasciare il becher nell'incubatrice per un'ora. Agitare il becher ogni 10-15 minuti durante l'incubazione per l'infiltrazione di paraffina nel tessuto. Quindi, aprire la cassetta e rimuovere il coperchio superiore.
Scegli uno stampo di metallo e versa una piccola quantità di paraffina per coprire il fondo dello stampo. Quindi rimuovi il bulbo oculare dalla cassetta con una pinza e posiziona una metà del bulbo oculare con il fondo della tazza verso l'alto e l'altra verso il basso sulla paraffina nello stampo. Quando il fazzoletto è ancorato in posizione, coprire accuratamente il bulbo oculare con paraffina e il fondo della cassetta per formare un blocco.
Trasferire il blocco su una piastra di raffreddamento per solidificare completamente. Dopo la solidificazione, rimuovere il blocco dallo stampo metallico e riposizionare i blocchi di paraffina sulla piastra di raffreddamento per 15 minuti. Fissare un blocco di paraffina nel microtomo.
Impostare il microtomo per tagliare la paraffina in eccesso dal blocco e tagliare fino a raggiungere il centro del bulbo oculare. Dopo aver modificato le impostazioni del microtomo, tagliare sezioni più sottili di 3,5 micrometri. Posizionare la sezione tagliata su una diapositiva.
Mettere il vetrino in un'incubatrice per 15 minuti affinché la paraffina si sciolga. Quindi posizionare il vetrino nello xilene. Successivamente, trasferire il vetrino in etanolo al 96%.
Dopo il trattamento con etanolo, lavare il vetrino in acqua corrente per cinque minuti. Posizionare il vetrino per due minuti nell'ematossilina di Mayer seguito da due minuti nell'ematossilina di Mayer con una soluzione pulita. Lavare lo scivolo due volte con acqua corrente per cinque minuti ciascuna.
Aggiungere l'1% di eosina per due minuti, seguito da etanolo per un minuto e 30 secondi ciascuno. Mettere il vetrino per due minuti nello xilene, seguito da un minuto di xilene con un altro becher con una soluzione pulita. Sigillare il vetrino utilizzando un sigillatore automatico per vetrini.
Per iniziare, su un computer, apri l'immagine del bulbo oculare di ratto scansionata ad alta risoluzione e trova le sezioni trasversali della pupilla trasversale. Ingrandisci la sezione trasversale selezionata scorrendo con il mouse. Quindi ruota il punto nell'angolo destro per regolare l'orientamento dell'immagine in modo che la retina sia orizzontale.
Fare clic sulla casella di ingrandimento nell'angolo in alto a destra e selezionare 20 volte per trovare la parte più spessa della retina. Quindi, fai clic con il pulsante destro del mouse per scegliere Annota e Righello. Posizionare il cursore del mouse sulla membrana limitante esterna nella parte più spessa della retina e fare clic con il pulsante sinistro per avviare la misurazione.
Quindi spostare il cursore perpendicolarmente alla membrana limitante interna e fare nuovamente clic sul pulsante sinistro per completare la misurazione. Intitola la misurazione come Spessore retinico e seleziona le caselle per mostrare il titolo e la lunghezza. Successivamente, utilizzando un righello, misurare lo spessore di ogni strato retinico, inclusi lo strato nucleare esterno, lo strato plessiforme esterno, lo strato nucleare interno e lo strato plessiforme interno ed etichettarli di conseguenza.
Per contare il numero di cellule all'interno dello strato di cellule ganglionari, selezionare una sezione della retina e, utilizzando il righello, misurare la distanza scelta lungo lo strato di cellule ganglionari. Per contrassegnare i corpi delle celle, premere il tasto destro del mouse e selezionare Annota, Salvato e 1 x RBC. Fare clic su ciascuna cellula identificata come un corpo rotondo e colorato di ematina nucleata lungo lo strato di cellule gangliari per la lunghezza predeterminata della retina.
Contare il numero di cellule cerchiate, lo spessore della retina, lo spessore dei singoli strati e il numero di cellule nello strato di cellule gangliari sono stati misurati e confrontati tra gli individui per valutare le caratteristiche della neurodegenerazione nella retina del roditore.
