ركز بحثنا على تطوير منهجية بسيطة خطوة بخطوة لإعداد الشرائح النسيجية وتقييم شبكية القوارض. يمكن استخدام نتائج الفحص النسيجي لشبكية العين للبحث في العديد من أمراض العيون ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية والأوعية الدموية. في الأدبيات المنشورة ، وصف منهجية الفحص النسيجي لمقل عيون القوارض محدود للغاية.
لا توجد أدلة خطوة بخطوة ، مما يجعل من الصعب على المبتدئين إعادة الإنشاء. نعتقد أن هذا البروتوكول سيكون مفيدا للباحثين الآخرين. على الرغم من وجود طرق أخرى يمكن استخدامها لتقييم مورفولوجيا شبكية العين ، بما في ذلك التصوير المقطعي للتماسك البصري ، إلا أن الفحص النسيجي المرضي يسمح بتقييم الخلايا المفردة ويوفر عددا أقل من القطع الأثرية.
وبالتالي ، يمكن أن يكون أكثر فائدة للبحث في الآليات المرضية لأمراض العيون. للبدء ، قم بإزالة مقل عيون الفئران المثبتة بالسكروز من الفريزر. قطع مقلة العين إلى نصفين على طول المستوى السهمي بمشرط حاد.
ثم قم بإزالة العدسة والتخلص منها. قم بإذابة مقلة العين في درجة حرارة الغرفة. انقل النصفين إلى كاسيت ، واشطفه تحت الماء الجاري لمدة 20 دقيقة لغسل السكروز.
جفف مقلة العين في زيادة تركيز الإيثانول لمدة 15 دقيقة لكل منها تحت غطاء الدخان ، مع الجفاف النهائي في الأسيتون لمدة سبع دقائق. لمسح مقلة العين ، ضعيها في الزيلين لمدة سبع دقائق تحت غطاء الدخان. أضف بعض البارافين الصلب في دورق ، وضعه في حاضنة مضبوطة على درجة حرارة أعلى من درجة حرارة الانصهار المحددة من قبل الشركة المصنعة للبارافين.
بعد ذوبان البارافين تماما ، حرك مقلة العين إلى الدورق واترك الدورق في الحاضنة لمدة ساعة واحدة. حرك الدورق كل 10 إلى 15 دقيقة أثناء الحضانة لتسلل البارافين إلى الأنسجة. بعد ذلك ، افتح الكاسيت وقم بإزالة الغطاء العلوي.
اختر قالبا معدنيا ، واسكب كمية صغيرة من البارافين لتغطية قاع القالب. ثم قم بإزالة مقلة العين من الكاسيت بالملقط ، وضع نصف مقلة العين مع قاع الكوب لأعلى والآخر لأسفل على البارافين في القالب. عندما يتم تثبيت الأنسجة في مكانها ، قم بتغطية مقلة العين بعناية بالبارافين وأسفل الكاسيت لتشكيل كتلة.
انقل الكتلة على لوحة التبريد لتتصلب بالكامل. بعد التصلب ، قم بإزالة الكتلة من القالب المعدني وضع كتل البارافين مرة أخرى على لوحة التبريد لمدة 15 دقيقة. قم بتأمين كتلة البارافين في الميكروتوم.
اضبط الميكروتوم لتقليم البارافين الزائد من الكتلة ، وقم بقصه حتى يتم الوصول إلى مركز مقلة العين. بعد تغيير إعدادات microtome ، قم بقص الأقسام الرقيقة من 3.5 ميكرومتر. ضع القسم المقطوع على شريحة.
ضع الشريحة في حاضنة لمدة 15 دقيقة حتى يذوب البارافين. ثم ضع الشريحة في الزيلين. بعد ذلك ، انقل الشريحة في 96٪ من الإيثانول.
بعد معالجة الإيثانول ، اغسل الشريحة بالماء الجاري لمدة خمس دقائق. ضع الشريحة لمدة دقيقتين في الهيماتوكسيلين الخاص بماير متبوعة بدقيقتين في الهيماتوكسيلين الخاص بماير بمحلول نظيف. اغسل الشريحة مرتين بالماء الجاري لمدة خمس دقائق لكل منهما.
أضف 1٪ eosin لمدة دقيقتين ، متبوعا بالإيثانول لمدة دقيقة واحدة و 30 ثانية لكل منهما. ضع الشريحة لمدة دقيقتين في الزيلين ، متبوعة بدقيقة واحدة من الزيلين مع دورق آخر بمحلول نظيف. أغلق الشريحة باستخدام مانع تسرب الشرائح الآلي.
للبدء ، على جهاز كمبيوتر ، افتح صورة مقلة عين الفئران الممسوحة ضوئيا عالية الدقة وابحث عن المقاطع العرضية للتلميذ المتقاطع. قم بتكبير المقطع العرضي المحدد عن طريق التمرير بالماوس. ثم قم بتدوير النقطة في الزاوية اليمنى لضبط اتجاه الصورة بحيث تكون شبكية العين أفقية.
انقر فوق مربع التكبير في الزاوية العلوية اليمنى وحدد 20 مرة للعثور على الجزء السميك من شبكية العين. بعد ذلك ، انقر بزر الماوس الأيمن على الماوس لاختيار التعليق التوضيحي والمسطرة. ضع مؤشر الماوس عند الغشاء المحدد الخارجي في الجزء السميك من شبكية العين، وانقر فوق الزر الأيسر لبدء القياس.
ثم حرك المؤشر بشكل عمودي على الغشاء المحدد الداخلي ، وانقر فوق الزر الأيسر مرة أخرى لإكمال القياس. قم بتسمية القياس بسمك الشبكية، وحدد المربعات لإظهار العنوان والطول. بعد ذلك ، باستخدام المسطرة ، قم بقياس سمك كل طبقة من طبقات الشبكية ، بما في ذلك الطبقة النووية الخارجية ، والطبقة الخارجية ، والطبقة النووية الداخلية ، والطبقة الضفيرية الداخلية ، وقم بتسميتها وفقا لذلك.
لحساب عدد الخلايا داخل طبقة الخلية العقدية ، حدد قسما واحدا من شبكية العين ، وباستخدام المسطرة ، قم بقياس المسافة المختارة على طول طبقة الخلية العقدية. لتمييز أجسام الخلايا ، اضغط على الزر الأيمن على الماوس وحدد تعليق توضيحي ومحفوظ و 1 × RBC. انقر فوق كل خلية تم تحديدها على أنها جسم دائري ملطخ بالهيماتين على طول طبقة الخلية العقدية على طول شبكية العين المحدد مسبقا.
احسب عدد الخلايا المحاصرة ، وسمك الشبكية ، وسمك الطبقات الفردية ، وعدد الخلايا في طبقة الخلية العقدية تم قياسها ومقارنتها عبر الأفراد لتقييم ميزات التنكس العصبي في شبكية القوارض.
