Nossa pesquisa se concentrou no desenvolvimento de uma metodologia simples passo a passo para preparar lâminas histológicas e avaliar a retina de roedores. Os resultados de um exame histológico da retina podem ser usados para pesquisas sobre muitas doenças oftálmicas, incluindo distúrbios neurodegenerativos e vasculares. Na literatura publicada, a descrição da metodologia para um exame histológico de globos oculares de roedores é muito limitada.
Faltam guias passo a passo, o que dificulta a recriação dos iniciantes. Acreditamos que este protocolo será útil para outros pesquisadores. Embora existam outros métodos que podem ser usados para avaliar a morfologia da retina, incluindo a tomografia de coerência óptica, o exame histopatológico permite a avaliação de células únicas e fornece menos artefatos.
Assim, pode revelar-se mais útil para a pesquisa dos mecanismos patológicos das doenças oftálmicas. Para começar, remova o paraformaldeído e os globos oculares de rato fixados em sacarose do freezer. Corte o globo ocular ao meio ao longo do plano sagital com um bisturi afiado.
Em seguida, remova e descarte a lente. Descongele o globo ocular à temperatura ambiente. Mova as duas metades para um e enxágue em água corrente por 20 minutos para lavar a sacarose.
Desidratar o globo ocular em concentrações crescentes de etanol por 15 minutos cada sob uma capela de exaustão, com desidratação final em acetona por sete minutos. Para limpar o globo ocular, coloque-o em xileno por sete minutos sob um exaustor. Adicione um pouco de parafina sólida em um béquer e coloque-o em uma incubadora ajustada para uma temperatura superior à temperatura de fusão especificada pelo fabricante da parafina.
Depois que a parafina estiver totalmente derretida, mova o globo ocular para dentro do béquer e deixe-o na incubadora por uma hora. Agite o béquer a cada 10 a 15 minutos durante a incubação para infiltração de parafina no tecido. Em seguida, abra o e remova a tampa superior.
Escolha um molde de metal e despeje uma pequena quantidade de parafina para cobrir o fundo do molde. Em seguida, remova o globo ocular do com uma pinça e coloque uma metade do globo ocular com a parte inferior do copo para cima e a outra para baixo sobre a parafina no molde. Quando o tecido estiver ancorado no lugar, cubra cuidadosamente o globo ocular com parafina e o fundo do para formar um bloco.
Transfira o bloco em uma placa de resfriamento para solidificar totalmente. Após a solidificação, remova o bloco do molde de metal e coloque os blocos de parafina de volta na placa de resfriamento por 15 minutos. Prenda um bloco de parafina no micrótomo.
Defina o micrótomo para aparar o excesso de parafina do bloco e apare até que o centro do globo ocular seja alcançado. Depois de alterar as configurações do micrótomo, corte seções mais finas de 3,5 micrômetros. Coloque a seção cortada em um slide.
Coloque a lâmina em uma incubadora por 15 minutos para que a parafina derreta. Em seguida, coloque a lâmina em xileno. Em seguida, transfira a lâmina para etanol a 96%.
Após o tratamento com etanol, lave a lâmina em água corrente por cinco minutos. Coloque a lâmina por dois minutos na hematoxilina de Mayer, seguidos de dois minutos na hematoxilina de Mayer com uma solução limpa. Lave a lâmina duas vezes com água corrente por cinco minutos cada.
Adicione 1% de eosina por dois minutos, seguido de etanol por um minuto e 30 segundos cada. Colocar a lâmina durante dois minutos em xileno, seguidos de um minuto de xileno com outro copo com uma solução limpa. Sele a lâmina usando um selador de lâminas automatizado.
Para começar, em um computador, abra a imagem do globo ocular do rato digitalizada em alta resolução e encontre as seções transversais da pupila cruzada. Amplie a seção transversal selecionada rolando com o mouse. Em seguida, gire o ponto no canto direito para ajustar a orientação da imagem para que a retina fique na horizontal.
Clique na caixa de ampliação no canto superior direito e selecione 20 vezes para encontrar a parte mais grossa da retina. Em seguida, clique com o botão direito do mouse para escolher Anotar e Régua. Posicione o cursor do mouse na membrana limitante externa na parte mais espessa da retina e clique com o botão esquerdo para iniciar a medição.
Em seguida, mova o cursor perpendicularmente à membrana limitadora interna e clique com o botão esquerdo novamente para concluir a medição. Nomeie a medida como Espessura da retina e marque as caixas para mostrar o título e o comprimento. Em seguida, usando uma régua, meça a espessura de cada camada da retina, incluindo a camada nuclear externa, a camada plexiforme externa, a camada nuclear interna e a camada plexiforme interna, e rotule-as de acordo.
Para contar o número de células dentro da camada de células ganglionares, selecione uma seção da retina e, usando a régua, meça a distância escolhida ao longo da camada de células ganglionares. Para marcar os corpos das células, pressione o botão direito do mouse e selecione Anotar, Salvo e 1 x RBC. Clique em cada célula identificada como um corpo redondo e nucleado corado com hematina ao longo da camada de células ganglionares ao longo do comprimento predeterminado da retina.
Conte o número de células circundadas, a espessura da retina, a espessura das camadas individuais e o número de células na camada de células ganglionares foram medidos e comparados entre os indivíduos para avaliar as características da neurodegeneração na retina de roedores.
