私たちの研究は、組織学的スライドを準備し、げっ歯類の網膜を評価するための簡単な段階的な方法論の開発に焦点を当てました。網膜の組織学的検査の結果は、神経変性疾患や血管障害など、多くの眼科疾患の研究に活用できます。発表された文献では、げっ歯類の眼球の組織学的検査の方法論の説明は非常に限られています。
ステップバイステップのガイドが不足しているため、初心者が再現するのが難しくなっています。このプロトコールは、他の研究者にも役立つと考えています。網膜の形態を評価するために使用できる他の方法(光コヒーレンストモグラフィーなど)がありますが、組織病理学的検査では単一細胞の評価が可能になり、アーティファクトが少なくなります。
したがって、眼科疾患の病態メカニズムの研究により有用であることが証明される可能性があります。まず、パラホルムアルデヒドとショ糖固定ラットの眼球を冷凍庫から取り出します。鋭いメスで矢状面に沿って眼球を半分に切ります。
次に、レンズを取り外して廃棄します。眼球を室温で解凍します。2つの半分をカセットに入れ、流水で20分間すすぎ、ショ糖を洗い流します。
ヒュームフードの下でエタノール濃度を上げて眼球をそれぞれ15分間脱水し、最後にアセトンで7分間脱水します。眼球をきれいにするには、ドラフトの下にキシレンに7分間置きます。ビーカーに固形パラフィンを加え、パラフィンメーカーが指定した融解温度よりも高い温度に設定したインキュベーターに入れます。
パラフィンが完全に溶けたら、眼球をビーカーに移し、ビーカーをインキュベーターに1時間放置します。インキュベーション中に10〜15分ごとにビーカーを攪拌し、パラフィンが組織に浸潤します。次にカセットを開けてトップカバーを取り外します。
金型を選び、型底を覆うように少量のパラフィンを注ぎます。次に、鉗子でカセットから眼球を取り出し、カップの底を上にして片方の眼球を半分、もう片方を下にして型内のパラフィンに置きます。ティッシュが所定の位置に固定されたら、眼球をパラフィンで慎重に覆い、カセットの底をブロック形成します。
ブロックを冷却プレートに移して、完全に固化させます。固化後、ブロックを金型から取り出し、パラフィンブロックを冷却プレートに15分間戻します。ミクロトームにパラフィンブロックを固定します。
ミクロトームをセットして、ブロックから余分なパラフィンをトリミングし、眼球の中心に達するまでトリミングします。ミクロトームの設定を変更した後、3.5μmの細い部分をカットします。カットした部分をスライドに置きます。
スライドをインキュベーターに15分間入れて、パラフィンを溶かします。次に、スライドをキシレンに入れます。これに続いて、スライドを96%エタノールで移します。
エタノール処理後、スライドを流水で5分間洗浄します。スライドをメイヤーのヘマトキシリンに2分間入れ、続いてメイヤーのヘマトキシリンに2分間、きれいな溶液を入れます。滑り台を流水で2回、それぞれ5分間洗います。
1%エオシンを2分間加え、続いてエタノールをそれぞれ1分30秒間加えます。スライドをキシレンに2分間入れ、続いてキシレンをきれいな溶液を入れた別のビーカーで1分間キシレンを置きます。自動スライドシーラーを使用してスライドをシールします。
まず、コンピューターで高解像度のスキャンされたラットの眼球画像を開き、交差瞳孔の断面を見つけます。選択した断面をマウスでスクロールして拡大します。次に、右隅のドットを回転させて、網膜が水平になるように画像の向きを調整します。
右上隅にある倍率ボックスをクリックし、20回選択して網膜の最も厚い部分を見つけます。次に、マウスを右クリックして[注釈]と[定規]を選択します。マウスカーソルを網膜の最も厚い部分の外部制限膜に置き、左ボタンをクリックして測定を開始します。
次に、カーソルを内部制限膜に対して垂直に移動し、もう一度左ボタンをクリックして測定を完了します。測定値のタイトルを「Retinal thickness」とし、タイトルと長さを表示するチェックボックスをオンにします。次に、定規を使用して、外側核層、外側網状層、内核層、内側網状層を含む各網膜層の厚さを測定し、それに応じてラベルを付けます。
神経節細胞層内の細胞数を数えるには、網膜の1つのセクションを選択し、定規を使用して、神経節細胞層に沿った選択した距離を測定します。セル本体をマークするには、マウスの右ボタンを押して、[注釈]、[保存済み]、および [1 x RBC] を選択します。網膜の所定の長さにわたって、神経節細胞層に沿って丸い有核ヘマチン染色体として識別された各細胞をクリックします。
囲まれた細胞の数を数え、網膜の厚さ、個々の層の厚さ、および神経節細胞層の細胞の数を測定し、げっ歯類の網膜の神経変性の特徴を評価するために、個人間で比較しました。
