Questo studio è stato condotto presso la Medical School Teaching Facility (MSTF, University of Maryland, Baltimore, MD, USA), accreditata dall'American Association for Laboratory Animal Science. Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali.
1. Selezione degli animali e stabulazione
- Utilizzare suini maschi adulti (Sus Scrofa) del peso di 60-80 kg.
- Dopo l'arrivo alla struttura per animali, alloggiare gli animali uno per gabbia ma con la possibilità di interagire con gli animali nelle gabbie vicine.
- Alloggiare gli animali per un minimo di 48 ore per garantire l'acclimatazione. Consentire agli animali il libero accesso all'acqua e nutrirli con una dieta standard fino alla notte prima dell'esperimento, quando gli animali dovrebbero essere a digiuno per ridurre al minimo il rischio di aspirazione durante l'intubazione.
- Monitorare regolarmente gli animali per verificare che siano in buona salute.
2. Sedazione e induzione dell'anestesia generale
- Sedare l'animale mentre si trova ancora nella sua area di stabulazione mediante iniezione intramuscolare di Telazol (4-5 mg/kg)/xilazina (1,8-2,2 mg/kg) caudale all'orecchio o nel muscolo gluteo.
- Trasportare l'animale dall'area di stabulazione alla sala operatoria e posizionarlo in decubito dorsale sul tavolo operatorio.
- Posizionare una sonda per pulsossimetria sull'orecchio dell'animale, posizionare una maschera facciale sul muso dell'animale e somministrare Isoflurano al 100% O2, fino a quando la mandibola non si è rilassata, per indurre l'anestesia.
- Posizionare un tubo endotracheale (ET) utilizzando un laringoscopio. Ciò dovrebbe essere ottenuto tenendo le mascelle aperte, estraendo la lingua, identificando l'epiglottide, passando la punta del laringoscopio nell'orofaringe e spostando l'epiglottide dal palato molle. Far avanzare il tubo ET attraverso le corde vocali di 6-10 cm e poi ruotarlo in una posizione curva verso il basso rispetto alla parte superiore della testa dell'animale.
- Gonfiare il bracciale ET con aria di 10 cm3, fissare il tubo ET al muso dell'animale utilizzando delle garze e auscultare il torace dell'animale per confermare il corretto posizionamento del tubo.
- Collegare il tubo ET a un ventilatore meccanico tramite uno scambiatore di calore e umidità.
- Verificare le impostazioni appropriate del ventilatore meccanico per erogare una frazione di O2 inspirata del 30%, con un volume corrente di 7-10 ml per kg di massa corporea, una frequenza respiratoria di 10-15 respiri/min, con l'obiettivo di una tensione di CO2 di fine espirazione di 38-42 mmHg.
- Per mantenere l'anestesia, utilizzare l'1,5-3% di isoflurano. Valuta regolarmente i parametri respiratori dell'animale.
3. Chirurgia
- Sterilizzazione e preparazione del sito chirurgico
- Rimuovere i peli sovrastanti il sito per l'incisione laparotomica e i siti di accesso percutaneo utilizzando un tagliacapelli elettrico.
- Strofinare tutti i siti di incisione e i siti di puntura percutanea con betadine e lasciare asciugare.
- Posizionare teli sterili intorno ai siti operativi per preservare i campi chirurgici sterili e prevenire la contaminazione. Fissali in posizione con le graffette.
- Ritrarre gli zoccoli anteriori e posteriori con una leggera flessione e trattenerli in posizione con una corda o del nastro adesivo.
- Posizionare gli elettrodi adesivi ECG sull'arto anteriore destro, sull'arto anteriore sinistro, sull'arto posteriore destro e sull'arto posteriore sinistro e sopra lo xifoide. Collegare gli elettrocateteri ECG corretti agli elettrodi adesivi.
- Laparotomia
- Utilizzare l'elettrocauterizzazione per praticare un'incisione addominale della linea mediana di 20 cm.
- Utilizzare l'elettrocauterizzazione per sezionare il tessuto sottocutaneo e la linea alba. Entrare nella cavità peritoneale sotto visione diretta utilizzando le forbici.
- Splenectomia
- Rimuovere la milza per evitare l'autotrasfusione in risposta al dissanguamento.
- Rilasciare la milza nella ferita della linea mediana, bloccare i vasi dell'ilo con due emostatici e sezionare tra gli emostatici. Legatura delle estremità sezionate con 0 cravatte di seta.
- Identificare i vasi gastrici corti più profondi, posizionare due emostatici, sezionare i vasi tra gli emostatici e legare le estremità con 0 lacci di seta.
- Ispezionare attentamente i vasi legati per garantire l'emostasi. Legare tutti i vasi sanguinanti.
- Esamina la milza in situ per assicurarti che sia sezionata libera e rimuovila.
- Cistostomia
- Erogare la vescica attraverso la ferita della laparotomia.
- Afferrare la parte ventrale della vescica tra due pinze DeBakey e praticare un'incisione di 1 cm con le forbici.
- Passare un catetere di aspirazione nell'apertura e rimuovere l'urina dalla vescica.
- Posizionare un catetere urinario da 14 Fr nella vescica. Gonfiare il palloncino del catetere con 10 ml di soluzione fisiologica.
- Posizionare una sutura con cordino della borsa utilizzando una sutura in nylon 3.0 per fissare il catetere nella vescica per evitare fuoriuscite di urina.
- Collegare il catetere a una sacca di raccolta.
- Chiudere la ferita laparotomica con un punto corrente utilizzando una sutura di nylon 3'0.
4. Strumentazione
NOTA: Vedere la Tabella 1 per i passaggi chiave nel collegamento del circuito SAAP.
- Accesso vascolare percutaneo
- Incannulamento della vena giugulare interna destra e sinistra (Figura 1)
- Utilizzando la guida ecografica (US), visualizzare la vena giugulare interna; Di solito si trova a circa 2-3 cm di profondità dalla pelle nel solco giugulare.
- Perforare la pelle con un ago da 18 G posizionato a un angolo di 45° rispetto alla pelle e introdurlo nel lume venoso sotto visione ecografica. Far passare un filo guida Seldinger da 0,035" attraverso l'ago.
- Rimuovere l'ago, avendo cura di lasciare il filo guida nel lume venoso.
- Praticare un'incisione cutanea di 5 mm adiacente al filo e infilare una guaina da 7 Fr con un dilatatore nella vena sopra il filo guida.
- Rimuovere il filo guida e l'introduttore, lasciando la guaina in posizione. Fissare la guaina in posizione suturandola sulla pelle con punti di sutura di seta 1.0.
- Ripetere i passaggi precedenti per incannulare la vena giugulare interna controlaterale.
NOTA: Una delle guaine della vena giugulare viene utilizzata per il monitoraggio della pressione atriale destra, l'altra può essere utilizzata per la somministrazione di farmaci a seconda del protocollo di studio. In alternativa, le vene giugulari esterne possono essere utilizzate per l'incannulamento.
- Incannulamento dell'arteria carotidea (Figura 1)
- Localizzare l'arteria carotide appena lateralmente alla trachea utilizzando la guida ecografica.
- Perforare la pelle con un ago da 18 G posizionato a un angolo di 45° rispetto alla pelle e introdurlo nel lume arterioso sotto visione ecografica, far passare un filo guida Seldinger da 0,035" attraverso l'ago.
- Rimuovere l'ago, avendo cura di lasciare il filo guida nel lume arterioso.
- Praticare un'incisione cutanea di 5 mm adiacente al filo e infilare una guaina da 7 Fr con un dilatatore nell'arteria sopra il filo guida.
- Rimuovere il filo guida e l'introduttore, lasciando la guaina in posizione. Fissare la guaina in posizione suturandola sulla pelle con punti di sutura di seta 1.0.
- Incannulamento dell'arteria femorale destra e sinistra
- Individuare l'arteria femorale destra nel canale femorale utilizzando la guida ecografica.
- Perforare la pelle con un ago da 18 G a un angolo di 45° rispetto alla pelle e introdurlo nel lume arterioso sotto visione ecografica. Far passare un filo guida Seldinger da 0,035" attraverso l'ago.
- Rimuovere l'ago, avendo cura di lasciare il filo guida nel lume arterioso.
- Praticare un'incisione cutanea di 10 mm adiacente al filo.
- Infilare una guaina da 14 Fr con un dilatatore nell'arteria sopra il filo guida.
- Rimuovere il filo guida e l'introduttore, lasciando la guaina in posizione. Fissare la guaina in posizione suturandola sulla pelle con punti di sutura di seta 1.0.
- Per l'accesso all'arteria femorale sinistra, individuare l'arteria femorale sinistra nel canale femorale utilizzando l'ecografia.
- Perforare la pelle con un ago da 18 G con un angolo di 45° e introdurlo nel lume arterioso sotto visione ecografica. Far passare un filo guida Seldinger da 90 cm 0,035" attraverso l'ago.
- Rimuovere l'ago, avendo cura di lasciare il filo guida nel lume arterioso.
- Praticare un'incisione cutanea di 10 mm adiacente al filo.
- Infilare una cannula ECMO lunga 18 cm e 15 Fr nell'arteria sopra il filo guida.
- Rimuovere il filo guida insieme al dilatatore e bloccare l'estremità distale della cannula per evitare il sanguinamento della schiena.
- Incannulamento della vena femorale
- Localizzare la vena femorale nel canale femorale utilizzando la guida ecografica.
- Perforare la pelle con un ago da 18 G con un angolo di 45° e introdurlo nel lume venoso sotto visione ecografica, far passare un filo guida Seldinger da 0,035" attraverso l'ago.
- Rimuovere l'ago, avendo cura di lasciare il filo guida nel lume venoso.
- Praticare un'incisione cutanea di 5 mm adiacente al filo e infilare un catetere venoso centrale da 9 Fr con un introduttore nella vena sopra il filo guida.
- Rimuovere il filo guida e l'introduttore, lasciando il catetere in posizione. Fissare la linea in posizione suturandola sulla pelle con suture di seta 1.0.
- Monitoraggio vascolare percutaneo (Figura 1)
- Pressione della radice aortica
- Utilizzando la fluoroscopia, introdurre un catetere micromanometrico nella guaina da 7 Fr nell'arteria carotide destra.
- Verificare che la punta del catetere si trovi nell'arco aortico visualizzando la forma d'onda della pressione aortica presentata nella schermata di raccolta dei dati.
- Pressione atriale destra
- Utilizzando la fluoroscopia, introdurre un catetere micromanometrico precedentemente calibrato nella guaina da 7 Fr nella vena giugulare interna destra.
- Confermare il posizionamento della punta del catetere nell'atrio destro osservando la forma d'onda della pressione presentata nella schermata di raccolta dati.
5. Dissanguamento
- Preparazione della configurazione
- Iniettare 15.000 UI di eparina non frazionata attraverso l'arma laterale della guaina IJV.
- Caricare il tubo di dissanguamento nel rullo della pompa peristaltica utilizzata per il dissanguamento.
- Collegare un'estremità del tubo al serbatoio del circuito utilizzando un tubo IV standard.
- Collegare l'altra estremità del tubo della pompa di dissanguamento utilizzando un accoppiatore dritto e un segmento da 2 pollici di tubo ID da 1/4" all'estremità della cannula ECMO da 15 Fr nell'arteria femorale.
- Rimuovere il morsetto dalla cannula da 15 Fr.
- Calcola gli intervalli del tasso di dissanguamento logaritmico utilizzando la formula5. La durata dell'intervallo e il tasso di dissanguamento dipendono dal protocollo di studio.

- Impostare la portata della pompa desiderata in base al protocollo utilizzando il software programmabile specifico per il computer della pompa -PUMPTERM.
- Collegare il computer alla pompa programmabile utilizzando una porta Ethernet standard. Una volta programmata la pompa controllata con la portata iniziale aggiornata visualizzata sul display digitale, può essere scollegata dal computer.
- Dissanguamento controllato da pompa
- Iniziare il dissanguamento premendo il pulsante START/STOP sulla pompa.
- Continuare il dissanguamento come da protocollo fino a quando la PEA non è dimostrata dalla perdita di pressione aortica (SBP <10 mmHg) con perdita di pulsatilità nella forma d'onda della pressione della radice aortica accompagnata dal ritmo ECG sinusale.
- Arrestare il dissanguamento premendo manualmente il pulsante START/STOP sulla pompa.
6. SAAP
- Preparazione del circuito SAAP
- Costruire il tubo del circuito utilizzando connettori a Y spinati e diritti e tubi con diametro interno da 3/8" per incorporare un ramo di riperfusione, un ramo di perfusione principale, un ramo di perfusione SAAP e un ramo di perfusione periferica (Figura 2). Fissare i collegamenti con fascette.
- Collegare il tubo prossimale al serbatoio del sangue.
- Collegare il tubo alla pompa centrifuga.
- Collegare il tubo all'ossigenatore.
- Collegare l'ossigenatore alla fonte di ossigeno utilizzando un tubo dell'ossigeno standard inserendolo nella porta di infusione dell'ossigeno sull'ossigenatore.
- Caricare l'arto di perfusione principale del circuito nella testa della pompa peristaltica.
- Erogare l'ossigeno a 6 L/min ruotando la manopola sulla bombola di ossigeno.
- Aggiungere 15.000 UI di eparina non frazionata nel serbatoio del circuito.
- Verificare che l'arto di perfusione del circuito sia bloccato e che l'arto di riperfusione sia aperto poiché il sangue versato viene pompato nel serbatoio del sangue durante il dissanguamento. Attivare la pompa centrifuga nel circuito SAAP premendo il pulsante START/STOP e impostare la portata ad ogni velocità. Ciò consentirà al sangue di circolare prevenendo la coagulazione.
- Segnare la lunghezza di inserimento del palloncino posizionandolo esternamente contro i punti di riferimento anatomici. Puntare a far sì che il palloncino si trovi nell'aorta toracica prossimale.
- Lavare il catetere SAAP e verificare che abbia un rubinetto a 3 vie collegato al mozzo del catetere.
- Verificare che il palloncino sia completamente sgonfio e verificare che il catetere abbia un rubinetto a 2 vie sulla porta del palloncino.
- Preriempire una siringa da 60 ml con una soluzione di 0,1 mg di adrenalina (in 1 ml), 10 ml di mezzo di contrasto e 49 ml di soluzione fisiologica. Questa soluzione è il bolo di chiusura della valvola aortica (AV) che verrà iniettato immediatamente prima della perfusione SAAP per prevenire il riempimento retrogrado del ventricolo sinistro.
- Preriempire un'altra siringa con 15 mL di soluzione fisiologica/di contrasto (1:1). Questo verrà utilizzato per gonfiare il palloncino del catetere.
- Impostare la pompa peristaltica nel circuito SAAP per erogare il perfusato (sangue ossigenato) a una velocità di 10 ml/kg del peso corporeo dell'animale programmando manualmente la pompa utilizzando i pulsanti "su" e "giù" sulla manopola della pompa.
- Consegna SAAP
- Inserire il catetere SAAP nella guaina da 14 Fr dell'arteria femorale a una lunghezza precedentemente determinata, collegare la siringa preriempita con 15 mL di soluzione di contrasto salina alla porta del palloncino (Figura 2) e iniettare il volume della siringa per gonfiare il palloncino.
- Confermare il posizionamento del palloncino con la fluoroscopia.
- Collegare l'arto di perfusione SAAP al catetere SAAP e l'arto di perfusione periferico al catetere venoso (Figura 3).
- Chiudere l'arto di riperfusione del circuito SAAP applicando il morsetto su di esso e aprire l'arto di perfusione togliendo il morsetto da esso (Figura 2).
- Collegare la siringa da 60 ml precedentemente preriempita con bolo di chiusura AV alla porta laterale del rubinetto a tre vie in corrispondenza del lume arterioso del catetere SAAP (Figura 3) e iniettare rapidamente manualmente l'intero volume della siringa, quindi chiudere la porta laterale della siringa.
- Aprire immediatamente l'apertura terminale del rubinetto dell'apertura arteriosa.
- Avviare la pompa peristaltica nel circuito SAAP premendo il pulsante RUN/STOP .
- Dopo sessanta secondi arrestare la pompa peristaltica premendo il pulsante RUN/STOP .
- Sgonfiare il palloncino SAAP aspirando l'intero volume dalla porta del palloncino SAAP.
- Chiudere il flusso al catetere con un rubinetto di arresto sul lume arterioso del catetere.
- Valutare il ritmo SBP ed ECG.
NOTA: Se dopo 2 minuti dall'inizio della PAS SAAP < 90 mmHg, è possibile infondere fino a 7 boli da 200 ml di sangue versato eparinizzato o sangue intero citrato pre-acquistato tramite il SAAP per mantenere la PAS >90 mmHg.
- Se il sangue conservato viene utilizzato per la SAAP, la coinfusione con gluconato di calcio è necessaria per prevenire il legame del citrato di calcio nel miocardio. Iniettare il gluconato di calcio immediatamente prima della perfusione SAAP utilizzando una siringa collegata alla porta laterale del rubinetto a 3 vie collegato al catetere SAAP. Utilizzare 1 grammo di gluconato di calcio per unità di globuli rossi confezionati e 3 grammi per unità di sangue intero5.
- Se l'animale sviluppa fibrillazione ventricolare o tachicardia ventricolare, tentare la defibrillazione posizionando delle palette sullo sterno e sull'apice e, dopo l'autorizzazione del personale, entrare in contatto con l'animale.
- Continuare la ventilazione, immediatamente prima di erogare gli shock, scollegare i trasduttori di pressione dalle unità di condizionamento del segnale, ricollegarli immediatamente dopo aver erogato lo shock.
- Erogare una scarica utilizzando un defibrillatore bifasico a partire da 150 J, rivalutare il ritmo per un massimo di un minuto successivo. Se sono presenti tachicardia ventricolare o fibrillazione, erogare fino a due ulteriori scosse a 200 J dopo un minuto di valutazione del ritmo dopo ciascuna scossa.
NOTA: L'algoritmo di defibrillazione utilizzato qui è per un defibrillatore bifasico, i defibrillatori monofasici di solito richiedono meno energia. Se vengono identificati altri ritmi cardiaci, la fibrillazione atriale, la PEA, ecc., la defibrillazione non deve essere tentata e l'animale deve essere trattato secondo uno specifico protocollo di studio.
7. Perfusione periferica
NOTA: Dopo la rianimazione SAAP riuscita, a seconda del protocollo di studio, è possibile continuare un'ulteriore sostituzione del volume in modo periferico utilizzando il circuito SAAP.
- Clamp l'arto di perfusione SAAP dell'arto di perfusione principale.
- Verificare che l'arto di perfusione periferica del circuito SAAP sia collegato al braccio laterale del catetere nella vena femorale e che i rubinetti e il tubo siano aperti.
- Assicurarsi che il liquido e il volume di rianimazione appropriati siano nel serbatoio SAAP.
- Assicurarsi che il lembo di ricircolo del circuito SAAP sia bloccato.
- Infondere il fluido in base alle esigenze del protocollo impostando le impostazioni di flusso appropriate sulla pompa peristaltica.
8. Eutanasia
- Al termine dell'esperimento, sopprimere l'animale iniettando >2 mmol/kg di cloruro di potassio in una vena centrale e attendere 1 minuto di asistolia.