Desenvolvimento de um sistema seletivo de perfusão do arco aórtico em um modelo suíno de parada cardíaca por exsanguinação

Resumo

O objetivo deste protocolo é demonstrar um modelo de parada cardíaca por exsanguinação suína e um circuito seletivo de perfusão do arco aórtico especificamente construído para pesquisa translacional.

Resumo

A hemorragia constitui a maioria das mortes potencialmente evitáveis por trauma. Há um interesse crescente em técnicas de ressuscitação endovascular, como a perfusão seletiva do arco aórtico (PAAA) para pacientes em parada cardíaca. Isso envolve a perfusão ativa da circulação coronária por meio de um cateter balão aórtico torácico e está se aproximando da aplicação clínica. No entanto, a técnica é complexa e requer refinamento em modelos animais antes que o uso humano possa ser considerado. Este artigo descreve um modelo animal de grande porte de parada cardíaca por exsanguinação tratado com um sistema SAAP sob medida.

Os suínos foram anestesiados, instrumentados e uma esplenectomia foi realizada antes que uma exsanguinação logarítmica controlada fosse iniciada. Os animais foram heparinizados e o sangue derramado coletado em um reservatório. Uma vez observada a parada cardíaca, o sangue foi bombeado através de um circuito extracorpóreo para um oxigenador e, em seguida, administrado através de um cateter balão de 10 Fr colocado na aorta torácica.

Isso resultou no retorno de uma circulação espontânea (ROSC), conforme demonstrado pelo ECG e pela forma de onda de pressão da raiz aórtica. Este modelo e o sistema SAAP que o acompanha permitem a recuperação padronizada e reprodutível da parada cardíaca por exsanguinação.

Introdução

A hemorragia é responsável pela maioria das mortes por trauma potencialmente evitáveis¹. Nos estágios terminais da exsanguinação, a perfusão coronariana é reduzida, levando à parada cardíaca e morte. As estratégias atuais – transfusão intravenosa e massagem cardíaca – são ineficazes, pois não abordam a falha da perfusão coronariana.

A SAAP é uma técnica de ressuscitação baseada em cateter que visa resolver esse problema pela infusão de fluido de ressuscitação oxigenado e drogas diretamente na aorta proximal, perfundindo a circulação coronária e cerebral. Estudos limitados em suínos demonstraram resultados promissores na restauração da atividade cardíaca após fibrilação ventricular e parada cardíaca hemorrágica ^2,3,4. No entanto, a pesquisa do SAAP está em andamento e a técnica permanece nas fases pré-clínicas.

Existem vários desafios técnicos com o SAAP. É fundamental que um certo volume de perfusato seja administrado através do cateter a uma taxa de infusão precisa e, atualmente, não há cateter aprovado pela FDA disponível comercialmente para uso em SAAP. A técnica requer um circuito específico que seja capaz de armazenar, oxigenar e fornecer perfusato de forma eficiente durante o SAAP. O objetivo deste estudo é apresentar um modelo animal de parada cardíaca por atividade elétrica sem pulso traumática (PEA) e um sistema SAAP confiável e personalizado para uso na exploração dessa ferramenta na pesquisa com animais de exsanguinação.

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Protocolo

Este estudo foi realizado no Medical School Teaching Facility (MSTF, University of Maryland, Baltimore, MD, EUA), que é credenciado pela American Association for Laboratory Animal Science. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais local.

1. Seleção e alojamento dos animais

1. Use suínos machos adultos (Sus Scrofa) pesando 60-80 kg.
2. Após a chegada ao biotério, abrigue os animais um por gaiola, mas com capacidade de interagir com os animais nas gaiolas vizinhas.
3. Alojar os animais por um período mínimo de 48 horas para garantir a aclimatação. Permitir que os animais tenham livre acesso à água e alimentá-los com uma dieta padrão até à noite anterior à experiência, altura em que os animais devem ser colocados em jejum para minimizar o risco de aspiração durante a intubação.
4. Monitore os animais regularmente para confirmar que estão em boas condições de saúde.

2. Sedação e indução de anestesia geral

1. Sedar o animal ainda em sua área de alojamento por injeção intramuscular de Telazol (4-5 mg / kg) / xilazina (1,8-2,2 mg / kg) caudal à orelha ou no músculo glúteo.
2. Transporte o animal da área de alojamento para a sala de cirurgia e coloque-o em decúbito dorsal na mesa de operação.
3. Coloque uma sonda de oximetria de pulso na orelha do animal, coloque uma máscara facial no focinho do animal e administre Isoflurano em 100% O_2, até que a mandíbula esteja relaxada, para induzir a anestesia.
4. Coloque um tubo endotraqueal (TE) usando um laringoscópio. Isso deve ser conseguido mantendo as mandíbulas abertas, puxando a língua, identificando a epiglote, passando a ponta do laringoscópio para a orofaringe e deslocando a epiglote do palato mole. Avance o tubo ET através das pregas vocais de 6 a 10 cm e, em seguida, gire-o em uma posição curva para baixo em relação ao topo da cabeça do animal.
5. Inflar o manguito ET com ar com 10 cm³, prender o tubo ET ao focinho do animal usando laços de gaze e auscultar o peito do animal para confirmar o posicionamento correto do tubo.
6. Conecte o tubo ET a um ventilador mecânico por meio de um trocador de calor e umidade.
7. Confirme as configurações apropriadas do ventilador mecânico para fornecer uma fração inspirada de O₂ de 30%, com um volume corrente de 7-10 mL por kg de massa corporal, uma frequência respiratória de 10-15 respirações/min, visando uma tensão expirada de CO₂ final de 38-42 mmHg.
8. Para manter a anestesia, use isoflurano a 1,5-3%. Avalie regularmente os parâmetros respiratórios do animal.

3. Cirurgia

1. Esterilização e preparação do sítio cirúrgico
   1. Remova o cabelo que cobre o local da incisão da laparotomia e os locais de acesso percutâneo usando um aparador de cabelo elétrico.
   2. Esfregue todos os locais de incisão e locais de punção percutânea com betadine e deixe secar.
   3. Coloque campos estéreis ao redor dos locais operatórios para preservar os campos cirúrgicos estéreis e evitar contaminação. Prenda-os no lugar com grampos.
   4. Retraia os cascos dianteiros e traseiros com uma leve flexão e prenda no lugar com corda ou fita adesiva.
   5. Coloque os eletrodos adesivos de ECG no membro anterior direito, no membro anterior esquerdo, no membro posterior direito e no membro posterior esquerdo e sobre o xifóide. Conecte os eletrodos de ECG corretos aos eletrodos adesivos.
2. Laparotomia
   1. Use eletrocautério para fazer uma incisão abdominal na linha média de 20 cm.
   2. Use eletrocautério para dissecar através do tecido subcutâneo e da linha alba. Entre na cavidade peritoneal sob visão direta usando uma tesoura.
3. Esplenectomia
   1. Remova o baço para evitar a autotransfusão em resposta à exsanguinação.
   2. Entregue o baço na ferida da linha média, prenda os vasos do hilo com dois hemostáticos e faça o transecto entre os hemostáticos. Ligando as extremidades seccionadas com 0 laços de seda.
   3. Identifique os vasos gástricos curtos mais profundos, coloque dois hemostáticos, corte os vasos entre os hemostáticos e ligue as extremidades com 0 laços de seda.
   4. Inspecione cuidadosamente os vasos ligados para garantir a hemostasia. Ligue quaisquer vasos sangrando.
   5. Examine o baço in situ para certificar-se de que está dissecado e remova-o.
4. Cistostomia
   1. Passe a bexiga através da ferida de laparotomia.
   2. Segure a parte ventral da bexiga entre dois grampos DeBakey e faça uma incisão de 1 cm usando uma tesoura.
   3. Passe um cateter de sucção na abertura e remova a urina da bexiga.
   4. Coloque um cateter urinário de 14 Fr na bexiga. Encha o balão do cateter com 10 mL de solução salina.
   5. Coloque uma sutura de cordão de bolsa usando uma sutura de náilon 3.0 para prender o cateter na bexiga para evitar derramamento de urina.
   6. Conecte o cateter a uma bolsa coletora.
   7. Feche a ferida de laparotomia com um ponto corrido usando uma sutura de náilon 3'0.

4. Instrumentação

NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter as principais etapas de conexão do circuito SAAP.

1. Acesso vascular percutâneo
   1. Canulação da veia jugular interna direita e esquerda (Figura 1)
      1. Usando orientação por ultrassom (US), visualize a veia jugular interna; Geralmente está localizado a cerca de 2-3 cm de profundidade da pele no sulco jugular.
      2. Perfure a pele com uma agulha de 18 G colocada em um ângulo de 45° em relação à pele e introduza-a no lúmen venoso sob visão de US. Passe um fio-guia Seldinger de 0,035" pela agulha.
      3. Remova a agulha, tomando cuidado para deixar o fio-guia no lúmen venoso.
      4. Faça uma incisão na pele de 5 mm adjacente ao fio e passe uma bainha de 7 Fr com um dilatador na veia sobre o fio-guia.
      5. Remova o fio-guia e o introdutor, deixando a bainha na posição. Prenda a bainha no lugar suturando-a na pele com suturas de seda 1.0.
      6. Repita as etapas acima para canular a veia jugular interna contralateral.
         NOTA: Uma das bainhas da veia jugular é usada para monitoramento da pressão atrial direita, a outra pode ser usada para administração de medicamentos, dependendo do protocolo do estudo. Alternativamente, veias jugulares externas podem ser usadas para canulação.
   2. Canulação da artéria carótida (Figura 1)
      1. Localize a artéria carótida logo lateral à traqueia usando orientação de US.
      2. Perfure a pele com uma agulha de 18 G colocada em um ângulo de 45° em relação à pele e introduza-a no lúmen arterial sob visão de US, passe um fio-guia de Seldinger de 0,035" pela agulha.
      3. Remova a agulha, tomando cuidado para deixar o fio-guia no lúmen arterial.
      4. Faça uma incisão na pele de 5 mm adjacente ao fio e passe uma bainha de 7 Fr com um dilatador na artéria sobre o fio-guia.
      5. Remova o fio-guia e o introdutor, deixando a bainha na posição. Prenda a bainha no lugar suturando-a na pele com suturas de seda 1.0.
   3. Canulação da artéria femoral direita e esquerda
      1. Localize a artéria femoral direita no canal femoral usando orientação de US.
      2. Perfure a pele com uma agulha de 18 G em um ângulo de 45° em relação à pele e introduza-a no lúmen arterial sob visão de US. Passe um fio-guia Seldinger de 0,035" pela agulha.
      3. Remova a agulha, tomando cuidado para deixar o fio-guia no lúmen arterial.
      4. Faça uma incisão na pele de 10 mm adjacente ao fio.
      5. Passe uma bainha de 14 Fr com um dilatador na artéria sobre o fio-guia.
      6. Remova o fio-guia e o introdutor, deixando a bainha na posição. Prenda a bainha no lugar suturando-a na pele com suturas de seda 1.0.
      7. Para o acesso arterial femoral esquerdo, localize a artéria femoral esquerda no canal femoral usando US.
      8. Perfure a pele com uma agulha de 18 G em um ângulo de 45° e introduza-a no lúmen arterial sob visão de US. Passe um fio-guia Seldinger de 90 cm 0,035" pela agulha.
      9. Remova a agulha, tomando cuidado para deixar o fio-guia no lúmen arterial.
      10. Faça uma incisão na pele de 10 mm adjacente ao fio.
      11. Passe uma cânula de ECMO de 18 cm de comprimento e 15 Fr na artéria sobre o fio-guia.
      12. Remova o fio-guia junto com o dilatador e prenda a extremidade distal da cânula para evitar o sangramento nas costas.
   4. Canulação da veia femoral
      1. Localize a veia femoral no canal femoral usando orientação de US.
      2. Perfure a pele com uma agulha de 18 G em um ângulo de 45° e introduza-a no lúmen venoso sob visão de US, passe um fio-guia de Seldinger de 0,035" pela agulha.
      3. Remova a agulha, tomando cuidado para deixar o fio-guia no lúmen venoso.
      4. Faça uma incisão na pele de 5 mm adjacente ao fio e rosqueie um cateter venoso central de 9 Fr com um introdutor na veia sobre o fio-guia.
      5. Remova o fio-guia e o introdutor, deixando o cateter na posição. Prenda a linha no lugar suturando-a na pele com suturas de seda 1.0.
2. Monitorização vascular percutânea (Figura 1)
   1. Pressão da raiz da aorta
      1. Usando fluoroscopia, introduza um cateter micromanômetro na bainha de 7 Fr na artéria carótida direita.
      2. Confirme se a ponta do cateter está no arco aórtico visualizando a forma de onda da pressão aórtica apresentada na tela de coleta de dados.
   2. Pressão atrial direita
      1. Usando fluoroscopia, introduza um cateter micromanômetro previamente calibrado na bainha de 7 Fr na veia jugular interna direita.
      2. Confirme a colocação da ponta do cateter no átrio direito observando a forma de onda de pressão apresentada na tela de coleta de dados.

5. Exsanguinação

1. Preparando a configuração
   1. Injete 15.000 UI de heparina não fracionada através da pistola da bainha do IJV.
   2. Carregue o tubo de exsanguinação no rolo da bomba peristáltica usada para a exsanguinação.
   3. Conecte uma extremidade da tubulação ao reservatório do circuito usando a tubulação IV padrão.
   4. Conecte a outra extremidade da tubulação da bomba de exsanguinação usando um acoplador reto e um segmento de 2 polegadas de tubulação de 1/4" ID à extremidade da cânula ECMO de 15 Fr na artéria femoral.
   5. Remova o clamp da cânula de 15 Fr.
   6. Calcule os intervalos logarítmicos da taxa de exsanguinação usando a fórmula⁵. A duração do intervalo e a taxa de exsanguinação dependem do protocolo do estudo.
      
   7. Defina a taxa de bomba desejada de acordo com o protocolo usando o software de computador de bomba específico programável -PUMPTERM.
   8. Conecte o computador à bomba programável usando uma porta Ethernet padrão. Uma vez que a bomba controlada é programada com a vazão inicial atualizada exibida no display digital, ela pode ser desconectada do computador.
2. Exsanguinação controlada por bomba
   1. Inicie a sangração pressionando o botão START/STOP na bomba.
   2. Continue a exsanguinação de acordo com o protocolo até que a PEA seja demonstrada pela perda da pressão aórtica (PAS <10 mmHg) com perda de pulsatilidade na forma de onda da pressão da raiz aórtica acompanhada de ritmo sinusal de ECG.
   3. Pare a sangração pressionando manualmente o botão START/STOP na bomba.

6. SAAP

1. Preparação do circuito SAAP
   1. Construa a tubulação do circuito usando conectores Y farpados e retos e tubulação de 3/8" ID para incorporar um membro de reperfusão, um membro de perfusão principal, um membro de perfusão SAAP e um membro de perfusão periférica (Figura 2). Prenda as conexões com braçadeiras.
   2. Conecte o tubo proximal ao reservatório de sangue.
   3. Conecte a tubulação à bomba centrífuga.
   4. Conecte a tubulação ao oxigenador.
   5. Conecte o oxigenador à fonte de oxigênio usando um tubo de oxigênio padrão, inserindo-o na porta de infusão de oxigênio do oxigenador.
   6. Carregue o ramo de perfusão principal do circuito no cabeçote da bomba peristáltica.
   7. Forneça o oxigênio a 6 L/min girando o botão no cilindro de oxigênio.
   8. Adicione 15.000 UI de heparina não fracionada no reservatório do circuito.
   9. Confirme se o ramo de perfusão do circuito está clampeado e se o ramo de reperfusão está aberto enquanto o sangue derramado é bombeado para o reservatório de sangue durante a exsanguinação. Ative a bomba centrífuga no circuito SAAP pressionando o botão START/STOP e defina o fluxo em qualquer taxa. Isso permitirá que o sangue circule, evitando a coagulação.
   10. Marque o comprimento de inserção do balão colocando-o externamente contra pontos de referência anatômicos. Apontar para que o balão fique na aorta torácica proximal.
   11. Lave o cateter SAAP e confirme se ele possui uma torneira de 3 vias conectada ao hub do cateter.
   12. Confirme se o balão está totalmente esvaziado e confirme se o cateter tem uma torneira de 2 vias na porta do balão.
   13. Encha previamente uma seringa de 60 ml com uma solução de 0,1 mg de epinefrina (em 1 ml), 10 ml de contraste e 49 ml de solução salina. Esta solução é o bolus de fechamento da válvula aórtica (AV) que será injetado imediatamente antes da perfusão SAAP para evitar o enchimento retrógrado do ventrículo esquerdo.
   14. Encha novamente outra seringa com 15 mL de solução salina/contraste (1:1). Isso será usado para inflar o balão do cateter.
   15. Defina a bomba peristáltica no circuito SAAP para fornecer o perfusato (sangue oxigenado) a uma taxa de 10 mL/kg do peso corporal do animal, programando manualmente a bomba usando os botões "para cima" e "para baixo" no botão da bomba.
2. Entrega SAAP
   1. Insira o cateter SAAP na bainha de 14 Fr na artéria femoral em um comprimento previamente determinado, conecte a seringa pré-preenchida com 15 mL de solução salina de contraste na porta do balão (Figura 2) e injete o volume da seringa para inflar o balão.
   2. Confirme a colocação do balão com fluoroscopia.
   3. Conecte o membro de perfusão SAAP ao cateter SAAP e o membro de perfusão periférica ao cateter venoso (Figura 3).
   4. Feche o braço de reperfusão do circuito SAAP aplicando a pinça nele e abra o braço de perfusão retirando o clamp dele (Figura 2).
   5. Conecte a seringa de 60 mL previamente pré-cheia com bolus de fechamento AV na porta lateral da torneira de três vias no lúmen arterial do cateter SAAP (Figura 3) e injete rapidamente manualmente todo o volume da seringa, seguido pelo fechamento da porta lateral da seringa.
   6. Abra imediatamente a porta final da torneira da porta arterial.
   7. Inicie a bomba peristáltica no circuito SAAP pressionando o botão RUN/STOP .
   8. Após sessenta segundos, pare a bomba peristáltica pressionando o botão RUN/STOP .
   9. Esvazie o balão SAAP aspirando todo o volume da porta do balão SAAP.
   10. Feche o fluxo para o cateter com a torneira de parada no lúmen arterial do cateter.
   11. Avalie o ritmo da PAS e do ECG.
       NOTA: Se após 2 minutos do início da PAS do SAAP < 90 mmHg, até 7 bolus de 200 mL de sangue derramado heparinizado ou sangue total citrato pré-comprado podem ser infundidos através do SAAP para manter a PAS >90 mmHg.
       1. Se o sangue armazenado for usado para SAAP, a co-infusão com gluconato de cálcio é necessária para evitar a ligação do citrato de cálcio no miocárdio. Injete gluconato de cálcio imediatamente antes da perfusão SAAP usando uma seringa conectada à porta lateral da torneira de 3 vias conectada ao cateter SAAP. Use 1 grama de gluconato de cálcio por unidade de hemácias e 3 gramas por unidade de sangue total⁵.
       2. Se o animal desenvolver fibrilação ventricular ou taquicardia ventricular, tente a desfibrilação colocando pás sobre o esterno e o ápice e, após a liberação do pessoal, entre em contato com o animal.
          1. Continue a ventilação, imediatamente antes de aplicar os choques, desconecte os transdutores de pressão das unidades de condicionamento de sinal - reconecte-os imediatamente após aplicar o choque.
          2. Aplique um choque usando um desfibrilador bifásico a partir de 150 J, reavalie o ritmo por até um minuto depois disso. Se houver taquicardia ou fibrilação ventricular, aplique até mais dois choques a 200 J após um minuto de avaliação do ritmo após cada choque.
             NOTA: O algoritmo de desfibrilação usado aqui é para um desfibrilador bifásico, os desfibriladores monofásicos geralmente requerem menos energia. Se outros ritmos cardíacos forem identificados, a desfibrilação atrial, PEA, etc., não deve ser tentada e o animal deve ser tratado de acordo com o protocolo específico do estudo.

7. Perfusão periférica

NOTA: Após a ressuscitação SAAP bem-sucedida, dependendo do protocolo do estudo, a reposição de volume adicional pode ser continuada perifericamente usando o circuito SAAP.

1. Clampeie o braço de perfusão SAAP do membro de perfusão principal.
2. Confirme se o ramo de perfusão periférica do circuito SAAP está conectado à arma lateral do cateter na veia femoral e se as torneiras e o tubo estão abertos.
3. Certifique-se de que o fluido e o volume de ressuscitação apropriados estejam no reservatório SAAP.
4. Certifique-se de que o ramo de recirculação do circuito SAAP esteja clamped.
5. Infundir o fluido de acordo com as necessidades do protocolo, definindo as configurações de fluxo apropriadas na bomba peristáltica.

8. Eutanásia

1. No final do experimento, eutanasiar o animal injetando >2 mmol/kg de cloreto de potássio em uma veia central e aguardar 1 minuto de assistolia.

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Resultados

A pressão arterial da raiz da aorta era de 83/58 mmHg no início do estudo e diminuiu gradualmente para 0-10 mmHg durante a exsanguinação. Após o início da atividade elétrica sem pulso (PEA), foi realizada a PAAE, durante a qual a pressão arterial sistólica aumentou rapidamente para 120 mmHg durante a PEAA (Figura 4). Após a cessação da PAAAS e da desinsuflação do balão aórtico, a BSP caiu para cerca de 60 mmHg, no entanto, aumentou gradualmen...

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Discussão

A oxigenação adequada do perfusato é uma capacidade crítica do SAAP¹². Usamos um filtro integrado a um reservatório. O filtro é conectado a um cilindro de oxigênio por meio de tubulação de oxigênio padrão. O fluxo de oxigênio é fornecido ao oxigenador a 6 L/min. A bomba centrífuga incorporada no circuito impulsiona o sangue, que é filtrado pelo oxigenador. A oxigenação adequada pode ser confirmada pela realização de uma gasometria de uma amostra...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3/8” ID tubing	Saint-Gobain	E-3603	This tubing is used throughout the circuit.
1/4" Tubing	Tygon	E-3603	2" segment for a connector between Exsanguination tubing and ECMO cannula
2-way stopcocks	Harvard Apparatus	72-2650	standard stopcock
3-way	Harvard Apparatus	72-2658	Standard stopcock
Barbed Connectors	Harvard Apparatus	72-1587	Y connectors
Barbed Connectors	Harvard Apparatus	72-1575	Straight connectors
Blood Reservoir	LivaNova	50715	This is sold together with the oxygenator
Cable ties	Commercial Electric	GT-200ST	Standard cable ties.
Centrifugal pump BVP-Z	ISMATEC	ISM 446	Centrifugal Pump used for recirculation of blood
Controlled Peristaltic Dispensing Pump	New Era Pump Systems	NE-9000B	Peristaltic pump for Exsanguination
ECMO Cannula	Medtronic	96570-015	Exsanguination cannula
Gas tubing	AirLife	1302	Standard oxygen tubing
Oxygen source	AirGas	OX USP300	Standard oxygen tank with flowmeter
Oxygenator	LivaNova	50715	This is sold together with the reservoir
Peristaltic pump 1 MCP	ISMATEC	ISM 405	SAAP peristaltic pump
SAAP catheter	n/a	n/a	Proprietary catheter designed by Dr. Manning
Venous catheter	Teleflex	CDC-29903-1A	9 French single lumen catheter