Microscopia multifotonica intravitale in tempo reale per visualizzare trattamenti a ultrasuoni e microbolle focalizzati per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica

Riepilogo

Questo protocollo descrive le procedure chirurgiche e tecniche che consentono l'imaging a fluorescenza multifotonica in vivo in tempo reale del cervello dei roditori durante i trattamenti a ultrasuoni e microbolle focalizzati per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica.

Abstract

La barriera emato-encefalica (BBB) è una sfida chiave per il successo della somministrazione di farmaci al cervello. L'esposizione agli ultrasuoni in presenza di microbolle è emersa come un metodo efficace per aumentare transitoriamente e localmente la permeabilità della BBB, facilitando il trasporto para- e transcellulare di farmaci attraverso la BBB. L'imaging della vascolarizzazione durante il trattamento con ultrasuoni-microbolle fornirà preziose e nuove informazioni sui meccanismi e le dinamiche dei trattamenti a ultrasuoni-microbolle nel cervello.

Qui, presentiamo una procedura sperimentale per la microscopia multifotonica intravitale utilizzando una finestra cranica allineata con un trasduttore ad anello e una lente obiettivo 20x. Questa configurazione consente l'imaging ad alta risoluzione spaziale e temporale del cervello durante i trattamenti a ultrasuoni-microbolle. L'accesso ottico al cervello è ottenuto tramite una finestra cranica a cranio aperto. In breve, un pezzo di cranio di 3-4 mm di diametro viene rimosso e l'area esposta del cervello viene sigillata con una copertura di vetro. Un trasduttore ad anello da 0,82 MHz, che è collegato a un secondo coperchio di vetro, è montato sulla parte superiore. L'agarosio (1% p/v) viene utilizzato tra il coverslip del trasduttore e il coverslip che copre la finestra cranica per prevenire le bolle d'aria, che impediscono la propagazione degli ultrasuoni. Quando vengono prese procedure chirurgiche sterili e misure antinfiammatorie, i trattamenti ecografici-microbolle e le sessioni di imaging possono essere eseguiti ripetutamente per diverse settimane. I coniugati destroni fluorescenti vengono iniettati per via endovenosa per visualizzare la vascolarizzazione e quantificare gli effetti indotti da ultrasuoni-microbolle (ad esempio, cinetica di perdita, cambiamenti vascolari). Questo documento descrive il posizionamento della finestra cranica, il posizionamento del trasduttore ad anello, la procedura di imaging, i passaggi comuni per la risoluzione dei problemi, nonché i vantaggi e le limitazioni del metodo.

Introduzione

Una sfida chiave per il trattamento dei disturbi neurologici è la presenza della barriera emato-encefalica (BBB). La BBB limita l'ingresso nel parenchima cerebrale ^di molecole idrofile, cariche, polari e grandi (> 400 Da). Un metodo attualmente utilizzato per fornire terapie attraverso la BBB nel parenchima cerebrale è quello di utilizzare iniezioni intracraniche ^{stereotassiche2}. Altri metodi meno invasivi in fase di studio sono ostacolati dalla complessità delle tecniche utilizzate, come la progettazione di farmaci per la somministrazione mediata da recettori attraverso la ^BBB3, o sono limitati nella precisione spaziale di aree mirate, come le iniezioni intranasali4 o la somministrazione di soluzioni iperosmotiche5.

L'uso degli ultrasuoni in combinazione con microbolle iniettate per via sistemica, un agente di contrasto ad ultrasuoni, è stato sviluppato come mezzo non invasivo per aumentare transitoriamente la permeabilità della ^BBB6. Utilizzando un trasduttore ^focalizzato7 o una serie di trasduttori ^{orientabili8,9}, gli ultrasuoni possono essere mirati a aree selezionate del cervello con precisione millimetrica, riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio. I trattamenti ad ultrasuoni-microbolle possono essere personalizzati in base all'anatomia cerebrale di ciascun soggetto utilizzando la guida per risonanza magnetica7,10,11,12,13,14 o fotogrammi stereotassica15. Inoltre, l'entità dell'aumento della permeabilità BBB può essere controllata in tempo reale monitorando le emissioni acustiche delle microbolle16,17,18. Studi clinici che studiano la sicurezza e la fattibilità dei trattamenti ecografici-microbolle sono attualmente in corso in tutto il mondo (ad esempio, identificatore ClinicalTrials.gov NCT04118764).

I trattamenti BBB a ultrasuoni-microbolle sono in genere valutati confermando gli aumenti indotti dal trattamento della permeabilità alla BBB, visualizzati nella risonanza magnetica potenziata dal contrasto o mediante stravaso del colorante nell'imaging in vivo o nell'istologia ex vivo. Tuttavia, la maggior parte delle analisi microscopiche sono state eseguite ex vivo, a seguito del completamento dei trattamenti ecografici-microbolle11,19, mancando così le risposte biologiche dinamiche durante e immediatamente dopo l'esposizione agli ultrasuoni. L'imaging in tempo reale condotto durante l'esposizione agli ultrasuoni può aiutare a comprendere i meccanismi che guidano i trattamenti BBB a ultrasuoni-microbolle e le risposte a valle, il che può aumentare la nostra comprensione delle sue applicazioni terapeutiche. Inoltre, l'uso di finestre craniche croniche con tecniche di imaging in vivo consentirebbe studi longitudinali per valutare gli aspetti temporali dei trattamenti ecografici-microbolle.

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere le procedure chirurgiche e tecniche necessarie per condurre l'imaging multifotone in tempo reale dei trattamenti ecografici-microbolle per studi acuti e cronici nei roditori (Figura 1). Ciò si ottiene in due parti: in primo luogo, per creare una finestra cranica per consentire l'imaging in vivo e, in secondo luogo, per montare un trasduttore ad anello sulla parte superiore per consentire la sonicazione e l'imaging simultanei. Le finestre craniche sono state ampiamente utilizzate dai neuroscienziati per l'imaging in vivo dell'accoppiamento ^{neurovascolare20}, della patogenesi β-amiloide21 e della neuroimmunologia22, tra gli altri. In questo protocollo, vengono descritte procedure chirurgiche per la creazione di finestre craniche acute (non di recupero) e croniche (recupero) nel cranio di topo e ratto. Le metodologie delle finestre craniche, in particolare per gli esperimenti cronici, sono state ben documentate23,24,25. Per essere coerenti con la letteratura esistente, i termini "acuto" e "cronico" saranno utilizzati in tutto questo protocollo. Anche la progettazione di trasduttori ad anello per l'imaging in vivo è stata precedentemente ^descritta26. Nonostante la disponibilità di queste tecniche e le intuizioni che possono essere ottenute dall'imaging in tempo reale dei trattamenti ecografici-microbolle, ci sono pochissimi laboratori di ricerca che hanno pubblicato con successo letteratura utilizzando questa tecnica26,27,28,29,30,31,32 . Come tale, in questo protocollo, vengono descritti i dettagli chirurgici e tecnici della conduzione di questi esperimenti ecografici-microbolle in tempo reale. Mentre i parametri di sonicazione e imaging specificati sono stati ottimizzati per gli esperimenti BBB, altri effetti dell'esposizione ad ultrasuoni al cervello, come la neuromodulazione33,34, il monitoraggio della placca β-amiloide31 e le risposte delle cellule ^{immunitarie32}, possono anche essere studiati utilizzando questa tecnica.

Protocollo

Tutte le seguenti procedure sperimentali sono state approvate e condotte in conformità con l'Autorità norvegese per la sicurezza alimentare, il Comitato per la cura degli animali del Sunnybrook Research Institute e il Consiglio canadese per la cura degli animali.

1. Preparazione del materiale

1. Preparare i materiali necessari per la chirurgia della finestra cranica e i trattamenti ecografici-microbolle. Per le finestre craniche croniche, sono necessari strumenti e materiali sterilizzati, uno spazio chirurgico sterile e la somministrazione di farmaci pre e post-operatorio23,24,25.
2. Trasduttore e preparazione coverslip
   1. Controlla l'integrità fisica del trasduttore: cerca crepe e ammaccature. Assicurarsi che gli elettrodi sulla parte superiore e laterale del trasduttore siano intatti.
   2. Deposita la colla cianoacrilata in un piccolo piatto. Utilizzare un applicatore per stendere un sottile strato di colla sulla superficie del trasduttore.
   3. Posizionare il trasduttore sul coperchio di vetro. Premere con decisione per 20-30 s.
      NOTA: uno stampo stampato in 3D può essere utilizzato per facilitare l'allineamento del coperchio di vetro con il trasduttore ad anello, garantendo una pressione ferma e uniforme sul coperchio e sul trasduttore ad anello (Figura 2).
   4. Verificare la presenza di bolle tra il trasduttore e il coperchio. Se ci sono bolle, togliere il coperchio e ripetere dal passaggio 1.2.3., poiché l'aria impedisce la propagazione degli ultrasuoni. Curare durante la notte a temperatura ambiente.
   5. Una volta aderito a un coperchio di vetro, abbinare il trasduttore (Figura 3).
      NOTA: questo protocollo utilizza un trasduttore ad anello di titanato di zirconato di piombo prodotto internamente (diametro esterno di 10 mm, spessore 1,4 mm, altezza 1,2 mm)³⁵, abbinato a un'impedenza di 50 Ω e un carico di fase di 0° con un circuito di corrispondenza personalizzato. Il trasduttore è azionato a 0,82 MHz in modalità spessore, producendo un punto focale circolare di circa 1 mm sotto il coverslip. Trasduttori ad anello di proprietà simili (diametro esterno 10 mm, spessore 1,5 mm, altezza 1,1 mm) sono stati ^{caratterizzati26} e ampiamente utilizzati per esperimenti di microscopia multifotonica27,28,29,31,32,36.
3. Riutilizzo del trasduttore e sostituzione del coverslip
   1. Sostituire il coperchio se è incrinato o ha detriti (ad esempio, pelliccia, colla) dell'esperimento precedente. Per rimuovere il coverslip, sciogliere la colla immergendo il trasduttore e il coverslip in acetone per 20 minuti.
      NOTA: l'acetone può influire sull'integrità del trasduttore e/o degli elettrodi. Verificare con il produttore prima di procedere con questo passaggio.
   2. Controllare se l'acetone ha sciolto la colla tirando delicatamente il coperchio con una pinza. Controllare una volta ogni 10 minuti per evitare un'esposizione prolungata all'acetone.

2. Preparazione degli animali

1. Anestetizzare l'animale utilizzando un mix di aria medica, ossigeno e isoflurano in una camera di induzione.
   NOTA: È stato riportato che l'uso di ossigeno come gas vettore influisce sull'emivita delle ^{microbolle37,38} e diminuisce l'entità degli aumenti indotti da ultrasuoni-microbolle nella permeabilità alla ^BBB27, ma può anche ridurre il rischio di ipossia e ^mortalità39. Scegli i gas di trasporto in base agli obiettivi del progetto e ai consigli veterinari. Possono essere utilizzati anche anestetici iniettabili come un cocktail di ketamina / xilazina; tuttavia, è più facile controllare il piano di anestesia e i livelli di ossigeno nel sangue quando si utilizzano anestetici inalabili.
2. Verificare che l'animale abbia raggiunto un piano sufficiente di anestesia eseguendo un pizzico di punta. Pesare l'animale per determinare il dosaggio di destrano, microbolle e farmaci da somministrare. Rimuovere la pelliccia dalla testa dell'animale e posizionare l'animale su una cornice stereotassica.
3. Per gli esperimenti acuti, l'accesso alla circolazione sistemica deve essere stabilito per le iniezioni di destrano e microbolle. Per raggiungere questo obiettivo, inserire un catetere da 27 g in una vena della coda.
   NOTA: Mentre sono possibili anche iniezioni retro-orbitali, le vene della coda sono raccomandate a causa dello spazio di lavoro limitato nell'area della testa durante l'imaging multifotone.
4. Trasferire l'animale sul telaio stereotassico e passare l'anestesia al cono del naso. Mantenere la temperatura interna dell'animale di 37 °C utilizzando una fonte di calore, come una piastra riscaldante o un guanto pieno di acqua tiepida.
5. Monitorare la temperatura animale utilizzando una sonda rettale e la fisiologia animale utilizzando un pulsossimetro. Applicare unguento oftalmico. Iniettare appropriati farmaci analgesici e/o antinfiammatori pre-chirurgici (vedi Tabella dei materiali).
6. Prima di iniziare l'intervento chirurgico alla finestra cranica, controllare il piano di anestesia e la frequenza cardiaca dell'animale, la saturazione di _O2 , la frequenza respiratoria e la temperatura.
7. Per iniziare l'intervento chirurgico alla finestra cranica, rimuovere la pelliccia sulla testa applicando una crema depilatoria e / o utilizzando tagliacapelli. Rimuovere la pelliccia tra gli occhi fino alla metà anteriore del collo (Figura 4A).
   NOTA: Il contatto prolungato con la crema depilatoria brucerà la pelle. Per gli interventi chirurgici cronici alle finestre craniche, lavare il cuoio capelluto con salviette alternate di betadina e 70% EtOH dopo la rimozione della pelliccia. Preparare lo spazio chirurgico per la chirurgia sterile. La sterilità deve essere mantenuta fino al punto 2.15.
8. Per rimuovere il cuoio capelluto, sollevare la pelle tra gli occhi usando una pinza tenuta nella mano non dominante, lungo la sutura sagittale. Usando le forbici curve, rimuovere la pelle per esporre le ossa parietali (Figura 4B). Applicare una pressione decisa con un batuffolo di cotone se c'è sanguinamento dal cranio o dal cuoio capelluto; il sanguinamento deve essere interrotto prima di passare al passaggio successivo.
   NOTA: Per gli interventi chirurgici acuti, la pelle può essere spinta indietro e aderita al cranio utilizzando colla liquida cianoacrilata o adesivo tissutale.
9. Rimuovere il periostio che copre la superficie esterna del cranio usando tamponi di cotone.
10. Utilizzando un microscopio operatorio (6-25x) e un trapano dentale (bava da 0,5 mm, velocità media), delineare un cerchio sull'osso parietale per segnare la posizione desiderata della finestra cranica sul cranio (Figura 5). Evitare la sutura sagittale, lambda e bregma, poiché queste aree sono più sottili e si sovrappongono a grandi vasi sanguigni.
    NOTA: Per facilitare la perforazione, un contorno della finestra cranica può essere disegnato sul cranio utilizzando un pennarello e uno stencil (Figura 5A). Per i ratti, potrebbe essere più facile forare una finestra rettangolare, invece di una circolare, cranica. A causa dello spessore dell'osso del cranio di ratto, utilizzare una punta da trapano da 0,7 mm per delineare la finestra cranica nell'osso compatto prima di utilizzare una punta da 0,5 mm per completare il processo di perforazione.
11. Applicare una leggera pressione con la punta del trapano; una pressione eccessiva aumenta il rischio di causare danni al tessuto cerebrale. Per evitare che il cranio si surriscaldi durante la perforazione, gocciolare soluzione salina sul cranio usando una siringa o applicare un pezzo di spugna chirurgica imbevuto di soluzione salina.
12. Alternare tra perforazione e raffreddamento del cranio fino a quando l'isola ossea risultante si separa dal resto del cranio. Controllare l'avanzamento della perforazione applicando una leggera pressione sull'isola ossea utilizzando una pinza o la punta del trapano. Continua a perforare fino a quando l'isola ossea non si separa dal resto del cranio.
    NOTA: Piccole crepe nelle aree più sottili del cranio sono una buona indicazione che la perforazione è quasi completa. Il tentativo di rimuovere prematuramente l'isola ossea può causare la penetrazione di pezzi di osso nel tessuto cerebrale, danneggiando la dura e causando infiammazione e sanguinamento.
13. Rimuovere l'isola ossea utilizzando una coppia di pinze sottili per afferrare i bordi, o lo strato osseo compatto superiore, dell'isola ossea (Figura 6A). Assicurarsi che il cervello sia mantenuto umido applicando un pezzo di spugna chirurgica che è stato pre-imbevuto di soluzione salina. Se si osserva sanguinamento, posizionare la spugna chirurgica sulla regione che sanguina. Non procedere al passaggio successivo fino a quando il sanguinamento non è cessato.
    NOTA: se il sanguinamento persiste dopo 5 minuti, l'animale non può essere utilizzato per esperimenti di imaging multifotonico. Per i ratti, potrebbe essere necessario rimuovere la dura se è spessa. Per rimuovere la dura, utilizzare un ingrandimento elevato sul microscopio operatorio e una coppia di pinze fini.
14. Per posizionare una finestra cranica, prendi una copertura di vetro con un paio di pinze, posiziona una goccia di soluzione salina su un lato e manovrala sopra il foro nel cranio. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria sotto il coperchio.
    NOTA: utilizzare un coperchio in vetro da 5 mm per i topi e 8 mm per i ratti. Per i ratti, a causa dello spessore dell'osso del cranio, utilizzare una soluzione di agarosio invece di soluzione salina per riempire lo spazio tra il coverslip e il cervello. Il trasduttore e il suo coverslip possono anche essere aderiti direttamente sul cranio, invece di utilizzare un coverslip separato per la finestra cranica. Per questa opzione, procedere al passaggio 3.1. Per informazioni dettagliate, fare riferimento alla Figura 1 .
15. Stendere uno strato di colla cianoacrilata attorno al perimetro del coverslip (Figura 6B) per attaccarlo al cranio. Assicurarsi che non ci sia colla sotto il coperchio. Applicare una pressione sul coperchio per assicurarsi che la colla non entri in contatto con il cervello.
16. Una volta che la colla è completamente asciutta, uniformare la superficie della colla usando il trapano dentale. Assicurarsi che tutti i detriti di colla vengano rimossi dall'area chirurgica.
    NOTA: per le finestre craniche croniche, iniettare i farmaci post-chirurgici necessari (vedere Tabella dei materiali), fornire unguento per la cura delle ferite e cibi morbidi e recuperare l'animale sotto una lampada di calore.

3. Posizionamento del trasduttore ad anello

1. Preparare la soluzione di agarosio all'1% (p/v). In un piccolo becher o in un matraccio Erlenmeyer, aggiungere 0,1 g di agarosio e 10 ml di PBS (1x) o soluzione salina. Far bollire la soluzione fino a quando l'agarosio non si è completamente dissolto posizionando il becher su una piastra elettrica o riscaldando la soluzione in un forno a microonde (30-45 s).
2. I passaggi 3.2-3.5 sono sensibili al fattore tempo poiché la soluzione di agarosio si raffredda rapidamente. Prelevare ~ 0,5 mL di agarosio in una siringa da 1 mL.
   NOTA: Per proteggere l'integrità del cervello, assicurarsi che la temperatura dell'agarosio si avvicini alla temperatura corporea prima dell'uso.
3. Depositare l'agarosio liberamente sul coperchio della finestra cranica.
   NOTA: Se il tessuto si sbollenta, la temperatura dell'agarosio era troppo alta; l'animale deve essere eutanasizzato. Se non esiste un coverslip separato che copra il cervello (cioè il trasduttore e il suo coverslip sono posizionati direttamente sul cervello, vedi passo 2.14), allora l'agarosio dovrebbe essere depositato sulla superficie del cervello in questo passaggio.
4. Posizionare il trasduttore sopra la finestra cranica (Figura 6C). Applicare una pressione decisa in modo tale che vi sia un minimo di agarosio tra il trasduttore e la finestra cranica. Assicurarsi che il trasduttore sia centrato (piano XY) e parallelo (piano Z) alla finestra cranica e che non vi siano bolle d'aria nell'agarosio.
5. Quando l'agarosio si è raffreddato a una consistenza gelatinosa, tagliare l'agarosio in eccesso dalla circonferenza del coperchio del trasduttore usando una spatola o un bisturi. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria sotto il coperchio del trasduttore.
6. Usando una spatola, stendi uno strato di colla cianoacrilata sulla circonferenza del coverslip del trasduttore, estendendosi al cranio, in modo tale che il trasduttore sia saldamente aderente al cranio.
7. Mantenere una forte pressione sul trasduttore fino a quando la colla non si è completamente asciugata (10-15 min).

4. Imaging al microscopio multifotonico

1. Posizionare l'animale sotto la lente dell'obiettivo (Figura 7A). Assicurarsi che l'obiettivo sia centrato nel trasduttore ad anello e parallelo al trasduttore (Figura 7B). Se si utilizza una lente ad immersione in acqua, riempire il centro del trasduttore ad anello con acqua deionizzata e degassata.
   NOTA: L'acqua degassata è importante per una corretta propagazione degli ultrasuoni.
2. Iniziare con l'obiettivo nella sua posizione più alta, quindi abbassare lentamente l'obiettivo fino a quando non si trova all'interno del trasduttore ad anello (Figura 7A, B). Assicurarsi che l'obiettivo non entri in collisione con il trasduttore o il coverslip.
   NOTA: Alternare tra l'oculare per verificare se la posizione Z della lente dell'obiettivo è in piano con la superficie del cervello e per occhio per assicurarsi che la lente dell'obiettivo non si scontri con il trasduttore o il coverslip. Può essere più facile visualizzare i vasi piali attraverso l'oculare dopo l'iniezione di destrano fluorescente attraverso la vena della coda (Figura 7C).
3. Preparare il microscopio multifotone per l'imaging.
   NOTA: Questo protocollo utilizza un microscopio multifotone verticale e una lente obiettivo 20-25x che ha una distanza di lavoro di 2 mm, che è sufficiente per mettere a fuoco oltre il coverslip (s), nel parenchima cerebrale.
4. Preparare il destrano. Aggiungere la quantità appropriata di PBS al flaconcino di destrano, secondo le istruzioni del produttore. Vortice la soluzione di destrano per 1-3 minuti per assicurarsi che la polvere di destrano sia completamente dissolta. Iniettare la soluzione di destrano nella vena della coda.
5. Impostazione di una scansione dell'immagine
   1. Utilizzando gli oculari, assicurarsi che la lente dell'obiettivo sia parallela al cervello. Inclinare l'animale per correggere i disallineamenti XZ e YZ.
   2. Selezionare un campo visivo in un microscopio multifotone. Impostare una scansione XYZ prima dell'esposizione agli ultrasuoni per avere un'immagine di base della vascolarizzazione prima dell'esposizione agli ultrasuoni.
      NOTA: i parametri di imaging tipici sono i seguenti: 300-800 μm di profondità, 2-5 μm di dimensione del passo e 10-20 pile di tempo. Assicurarsi che l'obiettivo non entri in contatto con il trasduttore o il coverslip nel punto più basso durante la sequenza di imaging.

5. Esposizione agli ultrasuoni

1. Assicurarsi che tutti i cavi BNC siano collegati correttamente (Figura 3).
2. Impostare una scansione dell'immagine XYZT sufficientemente lunga da catturare pile di immagini prima, durante e dopo i trattamenti a ultrasuoni-microbolle.
3. Preparare le microbolle seguendo le istruzioni del produttore. Iniettare le microbolle nella vena della coda e iniziare l'imaging.
   NOTA: le iniezioni di microbolle possono essere eseguite con una pompa per infusione per garantire una velocità di iniezione costante e per consentire l'iniezione e l'imaging simultanei di microbolle. Se le microbolle devono essere iniettate durante l'imaging, assicurarsi che la vena della coda sia facilmente accessibile senza esporre i rilevatori alla luce ambientale.
4. Inizia la sonicazione.
   NOTA: I parametri tipici di sonicazione sono i seguenti: cicli di 10 ms, indice meccanico di 0,2-0,4 e frequenze di ripetizione degli impulsi tra 1-4 Hz. I parametri di sonicazione e microbolle utilizzati negli studi preclinici ecografici-microbolle sono stati ampiamente studiati e sono ben documentati in letteratura (ad esempio vedere ⁴⁰ per una revisione).
5. Continua l'imaging multifotonico per tutta la durata della sonicazione e dopo la fine della sonicazione. Prestare attenzione allo stravaso destrone dai vasi sanguigni, in quanto ciò è indicativo di aumenti della permeabilità alla BBB.
   NOTA: Se il destrano viene rilevato nello spazio extravascolare, ma nella periferia del campo visivo, allora potrebbero esserci vasi sanguigni interessati al di fuori del campo visivo. Ciò può derivare da un disallineamento del trasduttore con la messa a fuoco della lente dell'obiettivo. In questo scenario, è più facile regolare il campo visivo spostando la lente dell'obiettivo o riposizionando l'animale, piuttosto che riallineare il trasduttore.
6. Una volta completata l'imaging, l'eutanasia della lussazione cervicale animale in anestesia profonda o asfissia di _CO2 . Per le finestre craniche croniche, stendere uno strato di cemento dentale sul cranio esposto.
   NOTA: Per le finestre craniche croniche, la pelle che circonda la finestra può essere suturata, anche se ciò non è necessario, a causa della rimozione del cuoio capelluto nel passaggio 2.8.

6. Analisi delle immagini

1. Esporta pile di immagini.
2. Analizza le immagini con software di analisi delle immagini (ad esempio, Olympus Fluoview, ImageJ/FIJI, Bitplane Imaris, ThermoFisher Scientific Amira) e/o strumenti di programmazione (ad esempio, Python, MATLAB).

Risultati

I trattamenti ecografici-microbolle di successo possono essere rilevati dallo stravaso del destrano fluorescente dallo spazio intravascolare a quello extravascolare (Figura 8), indicando un aumento della permeabilità BBB. A seconda del campo di pressione del trasduttore ad anello, i vasi piali e/o i capillari saranno interessati.

Per valutare i cambiamenti vascolari indotti dai trattamenti ecografici-microbolle, il diametro del vaso di interesse può essere misurato prima, durante e dopo il trattamento ecografico-microbolle (Figura 9). Questo può essere fatto manualmente in un software disponibile in commercio (ad esempio, il software Olympus Fluoview). Durante l'acquisizione dell'immagine, le iniezioni di destrano in bolo e le scansioni di linea possono anche essere utilizzate per valutare il flusso ^{sanguigno30,41}. Per valutare la cinetica della perdita di destrano come modello rappresentativo per la somministrazione di farmaci, l'intensità del segnale tra gli spazi intra ed extravascolari può essere valutata utilizzando strumenti come MATLAB26,27,29,41 (Figura 10).

Un'ulteriore elaborazione delle immagini può essere ottenuta utilizzando ImageJ/FIJI. ImageJ/FIJI è un software open source compatibile con MATLAB ed è adatto per condurre analisi comuni nell'analisi delle immagini biologiche, come la misurazione dei cambiamenti vascolari o delle lunghezze o della distanza tra oggetti fluorescenti (ad esempio, placche β-amiloide ai vasi sanguigni). Le pipeline di elaborazione delle immagini create in ImageJ/FIJI possono essere automatizzate scrivendo macro personalizzate.

Analisi più complesse, come la segmentazione 3D dei vasi sanguigni e il tracciamento cellulare, possono essere ottenute utilizzando un software semi-automatizzato più avanzato (Figura 11). Dopo la segmentazione, possono essere condotte analisi più specifiche, come la classificazione dei vasi sanguigni come arteriole, venule o capillari, in base a diametro, ramificazione, modelli di tortuosità e direzione del ^flusso42,43. Sono stati inoltre sviluppati algoritmi di apprendimento automatico per automatizzare la segmentazione dei vasi ^{sanguigni22,44}.

Figura 1: Flusso di lavoro generale degli esperimenti cerebrali intravitali multifotone multifotone ecografici-microbolle. Viene mostrato un flusso di lavoro generale degli esperimenti cerebrali intravitali multifotone a ultrasuoni-microbolle descritti in questo protocollo. Ci sono 6 fasi: (A) Preparazione animale per (A1) topi e (A2) ratti, (B) Iniezione di destrano, (C) Iniezione di microbolle, (D) Imaging pre-trattamento, (E) Trattamento e imaging, (F) Imaging post-trattamento e analisi dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Sezione trasversale e vista dall'alto dello stampo stampato in 3D. (A) Sezione trasversale dello stampo. Un sottile strato di colla cianoacrilata viene applicato sulla superficie superiore del trasduttore ad anello e un coperchio viene posizionato sopra. Un timbro può essere utilizzato per applicare una pressione ferma e uniforme sul coperchio e sul trasduttore ad anello. (B) Vista dall'alto dello stampo. Una tacca può essere aggiunta nello stampo per facilitare la rimozione del trasduttore preparato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Configurazione ad ultrasuoni. Viene mostrato l'hardware tipico per gli esperimenti ad ultrasuoni. I parametri ad ultrasuoni sono impostati e attivati dal generatore di segnale e amplificati dall'amplificatore. Un misuratore di potenza può essere utilizzato per registrare le potenze in avanti e riflesse prima di inviare il segnale alla scatola corrispondente, che viene abbinata al trasduttore. Tutte le connessioni sono realizzate utilizzando cavi BNC se non diversamente specificato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Area di rimozione della pelliccia e rimozione del cuoio capelluto. (A) La rimozione della pelliccia dovrebbe iniziare tra gli occhi e estendersi fino alla metà anteriore del collo. (B) La rimozione del cuoio capelluto dovrebbe essere sufficiente per esporre le ossa parietali. Il sanguinamento deve essere interrotto prima di procedere. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Contorno della finestra cranica. La finestra cranica è situata su un osso parietale. (A) Un contorno della finestra cranica può essere disegnato sul cranio per aiutare nel processo di perforazione. (B) Il contorno della finestra cranica può essere visto dopo la perforazione attraverso l'osso compatto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Allineamento della finestra cranica e del trasduttore. (A) La finestra cranica viene creata su un osso parietale. L'isola ossea è stata rimossa, esponendo il cervello sottostante. (B) La finestra cranica è completa quando una copertura di vetro è sigillata sul cranio usando colla cianoacrilata. (C) Il trasduttore è centrato sulla finestra cranica e aderito utilizzando colla cianoacrilica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Posizionamento della lente dell'obiettivo e del trasduttore. (A,B) La lente dell'obiettivo è centrata sul trasduttore ad anello. (C) I vasi sanguigni pieni di destrano fluorescente sono visibili attraverso gli oculari, sotto epifluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Immagini multifotoniche a proiezione massima di ultrasuoni-microbolle indotte da aumenti della permeabilità BBB. Immagini di proiezione massima della vascolarizzazione (A) prima e (B) dopo i trattamenti ecografici-microbolle. Il successo dei trattamenti ecografici-microbolle può essere confermato osservando aumenti della permeabilità alla BBB dopo il trattamento, visualizzati come stravaso fluorescente di destrano (frecce). Barra della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Analisi della vasomodulazione indotta da trattamenti ecografici-microbolle. Immagini di proiezione massime dei vasi sanguigni cerebrali prima, durante e dopo i trattamenti ad ultrasuoni-microbolle. Le microbolle sono presenti in tutte le immagini. Rispetto alle condizioni di pre-trattamento (A), è possibile osservare una chiara vasomodulazione (B) durante i trattamenti ecografici-microbolle (frecce rosse). Gli aumenti mediati da ultrasuoni-microbolle della permeabilità alla BBB sono evidenti anche dopo il trattamento dalla fuoriuscita di destrano fluorescente dallo spazio intravascolare a quello extravascolare (frecce gialle). (C) Quando l'ecografia è disattivata, i diametri vascolari ritornano al pre-trattamento, dimensioni basali. (D) I cambiamenti vascolari possono essere analizzati tracciando il diametro del vaso di interesse prima, durante e dopo il trattamento ecografico-microbolle. Barra di scala: 100 μm. (Opera inedita). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Analisi della cinetica delle perdite a seguito di trattamenti ecografici-microbolle. L'aumento della permeabilità BBB è visualizzato come perdita di destrano fluorescente dallo spazio intravascolare a quello extravascolare. I cambiamenti nella permeabilità BBB sono evidenti quando si confrontano le pile di immagini acquisite (A) prima e (B) dopo i trattamenti a ultrasuoni-microbolle. (C) La cinetica delle perdite può essere analizzata monitorando l'intensità, il volume e la velocità del destrone nei compartimenti extravascolari (rettangolo giallo). Barra di scala: 50 μm. (Opera inedita.) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: Segmentazione dei vasi sanguigni della pila XYZ per microscopia multifotonica. (A) Pila di profondità (XYZ) dei vasi sanguigni in un ratto EGFP transgenico. I vasi sanguigni vengono visualizzati tramite iniezione endovenosa di texas red fluorescente 70 kDa destrano (rosso). Il canale verde mostra le cellule fluorescenti e l'autofluorescenza dei tessuti. (B) Vengono create ricostruzioni 3D dei vasi sanguigni e quindi codificate per colore in base al tipo di vaso sanguigno per facilitare le analisi specifiche del tipo. Le vene / venule sono blu, le arterie / arteriole sono rosse e i capillari sono ciano. Barra scala: 50 μm. Ricostruzioni realizzate utilizzando Bitplane Imaris. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il monitoraggio al microscopio multifotonico intravitale del cervello è uno strumento prezioso per studiare le risposte cerebrali durante l'esposizione agli ultrasuoni. Per quanto ne sappiamo, il protocollo qui descritto è l'unico metodo per condurre l'imaging al microscopio multifotonico del parenchima cerebrale durante i trattamenti ad ultrasuoni-microbolle. La creazione di finestre craniche e l'uso di trasduttori ad anello consentono il monitoraggio in tempo reale delle risposte vascolari, cellulari e di altro tipo a valle ai trattamenti ecografici-microbolle ad alta risoluzione spaziale e temporale. Altri gruppi hanno eseguito l'imaging al microscopio multifotone dopo il completamento dei trattamenti ecografici-microbolle, mancando così la risposta in tempo reale del parenchima cerebrale ai ^{trattamenti19}. La procedura descritta offre un migliore controllo temporale, consentendo la raccolta di dati che possono aiutare a illuminare i meccanismi acuti alla base dei trattamenti ecografici-microbolle. I dati quantitativi e qualitativi possono essere estratti e analizzati dalle pile di immagini acquisite, come la cinetica dello stravaso27,29,30, i cambiamenti nel volume della placca β-amiloide31 e la dinamica ^cellulare32.

Diversi passaggi per la risoluzione dei problemi sono stati evidenziati in tutto il protocollo. In primo luogo, sono stati enfatizzati i passaggi chirurgici particolarmente suscettibili all'errore dell'operatore, come l'uso di agarosio durante la chirurgia della finestra cranica e il posizionamento del trasduttore. Sono state fornite anche misure per prevenire il disagio e la morte degli animali, tra cui il monitoraggio della fisiologia animale durante l'intervento chirurgico e il vortice completo del destro prima dell'iniezione. In secondo luogo, sono state evidenziate anche le specifiche fisiche del trasduttore e l'allineamento della lente dell'obiettivo, del trasduttore e della finestra cranica. Le specifiche del trasduttore ad anello e le sue proprietà acustiche devono essere determinate in considerazione della lente dell'obiettivo utilizzata e del modello animale. In particolare, il diametro interno del trasduttore ad anello deve essere abbastanza grande da circondare la lente dell'obiettivo, ma abbastanza piccolo da essere montato saldamente sul cranio dell'animale. Inoltre, l'area focale del trasduttore deve allinearsi con la portata dell'obiettivo utilizzato.

Una sfida comune è che la finestra cranica e il trasduttore ad anello sono angolati rispetto alla lente dell'obiettivo. Il corretto centraggio (XY) e l'allineamento (Z) della lente dell'obiettivo con la finestra cranica e il trasduttore assicurano che l'area focale del trasduttore, e quindi la regione del tessuto cerebrale trattato, si allinei con il campo visivo di imaging e riduca il rischio di collisione tra la lente dell'obiettivo e il trasduttore durante l'imaging. L'allineamento può essere ottenuto regolando la posizione della testa dell'animale e/o ruotando il telaio stereotassico in cui è fissato.

I componenti del microscopio (ad esempio, rivelatori, splitter) e i parametri di acquisizione delle immagini devono essere selezionati in base allo scopo dello studio. Qui, viene utilizzato un obiettivo con una lunga lunghezza focale (> 2 mm) a causa della presenza del coverslip (s) e del trasduttore ad anello situato tra la lente dell'obiettivo e il cervello. Un microscopio verticale è anche raccomandato in quanto consente più spazio per manovrare l'animale, in particolare per gli esperimenti cerebrali. Per catturare la cinetica della perdita indotta da ultrasuoni-microbolle del colorante intravascolare, è favorevole un'alta risoluzione temporale, che può essere ottenuta utilizzando un sistema di scansione di risonanza. La combinazione di questo con un sistema di rilevamento ad alta sensibilità, come i rilevatori di fosfuro di arseniuro di gallio (GaAsP), si tradurrà anche in immagini più favorevoli.

La procedura sperimentale presentata presenta diverse limitazioni. In primo luogo, la procedura chirurgica è piuttosto invasiva ed è stato segnalato per causare ^{infiammazione45}, anche se l'infiammazione può essere ridotta al ^minimo46. Inoltre, le risposte immunitarie indotte da interventi chirurgici alle finestre craniche sono state osservate per risolversi entro 2-4 settimane dopo l'intervento chirurgico23,24,25. Inoltre, il processo di perforazione, in particolare se condotto con forza o velocità eccessive, può causare danni al tessuto sottostante a causa della generazione di calore, vibrazioni e pressione applicata. Sono stati osservati anche interventi chirurgici alle finestre craniche e imaging multifotonico che influenzano la temperatura ^cerebrale47. Queste limitazioni possono essere ridotte in una certa misura attraverso un'attenta creazione di finestre craniche incontaminate, un corretto recupero di animali con finestre craniche croniche e il mantenimento della temperatura corporea normotermica utilizzando una fonte di riscaldamento con controllo di feedback. In secondo luogo, la profondità di imaging è limitata dal microscopio e dalla lente dell'obiettivo utilizzati. Ad esempio, l'effetto del trattamento con ultrasuoni-microbolle in strutture cerebrali più profonde, come l'ippocampo, non può essere studiato senza misure più invasive, come la rimozione del tessuto corticale ^{sovrastante48} o l'uso di microlenti in combinazione con la penetrazione corticale49. L'uso di una lente obiettiva con una lunga distanza di lavoro potrebbe risolvere questo problema in una certa misura, ma la penetrazione della luce è anche limitata a profondità maggiori.

Mentre le immagini rappresentative di questo protocollo sono state acquisite da roditori selvatici, la procedura sperimentale presentata può essere applicata anche ad animali transgenici e modelli di malattie, come il morbo di ^Alzheimer31. Anche gli esperimenti ecografici non correlati alla modulazione della BBB, come la neuromodulazione indotta da ultrasuoni, possono essere monitorati utilizzando questo ^{protocollo33,34}. Altre possibili applicazioni possono essere ottenute utilizzando diversi microscopi o set-up di rivelatori, come l'associazione di un microscopio confocale con una telecamera ad altissima ^velocità50. Mentre il fotosbiancamento e la fototossicità sono relativamente peggiori nei microscopi confocali a causa del grande volume di eccitazione, l'imaging ad altissima velocità può consentire la visualizzazione delle interazioni cellula-microbolle endoteliale capillare cerebrale con alta risoluzione temporale, che potrebbe illuminare ulteriormente i meccanismi che guidano i trattamenti BBB ultrasuoni-microbolle. Per concludere, il protocollo descritto fornisce un metodo per monitorare gli effetti vascolari e cellulari indotti da esperimenti BBB a ultrasuoni-microbolle in tempo reale, fornendo uno strumento per determinare ulteriormente i meccanismi che guidano questi trattamenti, oltre a illuminare le risposte a valle del parenchima cerebrale ai trattamenti ecografici-microbolle.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ring transducer placement
Agarose (powder)	Sigma-Aldrich	A9539
Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml)	VWR	213-0462 or 214-1130
Cyanoacrylate glue (gel)	Loctite	1363589
Glass coverslips (13 mm)	Thermo Fisher Scientific	CB00130RA120MNT0	Coverslip for ring transducer.
Hot plate or microwave	Corning	PC-400D	To heat agarose solution.
PBS (1X)	Sigma-Aldrich	P4417
Ring transducer	Custom-made	Custom-made	Custom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518
Rubber stopper	VWR	217-0867
Animal preparation and drugs
Bupivacaine*A	Aspen	169912	Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site.
Buprenorphine*A	Indivior	521634	Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery.
Buprenorphine*A	Indivior	521634	Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c..
Carprofen*C	Pfizer	DIN 02255693	Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery.
Depilatory cream	Veet	N/A	For complete fur removal after trimming.
Dexamethasone*C	Sandoz	DIN 00664227, 2301	Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery.
Enrofloxacin*C	Bayer	DIN: 02249243	Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery.
Fur clippers	Aesculap	90200714	Exacta/Isis.
Heating pad	Physitemp Instruments INC	HP-1M
Isoflurane	Baxter	ESDG9623C	Dose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic.
Meloxicam*A	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH	25388	Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery.
Meloxicam*A	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH	25388	Dose rat: 1 mg/kg, s.c.
Pulse oximeter	STARR Life Sciences Corp	N/A	MouseOx.
Stereotaxic frame	Kopf	Kopf 900
Sterile ophthalmic ointment	Théa	597562	Viscotears.
Tail vein catheter (24 G)	BD Neoflon	391350
* Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified.
Material and equipment for cranial window placement
Alcohol swabs	BD	326895
Curved fine surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Cotton or fibreless swabs	Chemtronics	CX50
Cyanoacrylate glue (gel)	Loctite	1594457 (gel), 230992 (liquid)	If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder.
Dental cement	Lang Dental	Jet Set-4 Denture Repair Package
Dental micromotor hand drill	FOREDOM	K.1070-2	High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet.
Forceps	Fine Science Tools	11152-10, 11370-40
Glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	CB00050RA120MNT0 (5 mm)	Mouse cranial windows.
Glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	CB00080RA120MNT0 (8 mm)	Rat cranial windows.
Micro drill burrs (0.5 mm)	Meisinger	HM71005 (0.5 mm)
Micro drill burrs (0.7 mm)	Meisinger	HM71007 (0.7 mm)
Stereo microscope	Nikon	SMZ645
Surgical gelatin sponge	Ethicon	MS0005
Vetbond Tissue adhesive	3M	1469SB
Weigh boats / trays	VWR	10803-148
* Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries.
Multiphoton microscopy
20x water immersion objective	Olympus	XLUMPLFLN20 XW	Numerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm.
Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa)	Sigma Aldrich	46945	Recommended 10 kDa-2 MDa.
MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillator	Spectra-Physics	N/A
SliceScope microscope	Scientifica	N/A
Ultrasound treatment
50 dB RF Amplifier	E&I	2100L
Matching circuit	Custom-made	Custom-made	Custom-made.
Microbubbles	Bracco Imaging	N/A	SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg.
Microbubbles	Lantheus	N/A	Definity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg.
Signal generator	Agilent Technologies	33500B