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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, dimostriamo l'uso della microscopia a fluorescenza (FLIM) per visualizzare in sequenza il metabolismo cellulare e la viscosità della membrana plasmatica in colture di cellule tumorali vive. Le valutazioni metaboliche vengono eseguite rilevando la fluorescenza endogena. La viscosità viene misurata utilizzando un rotore molecolare fluorescente.

Abstract

La viscosità è un'importante proprietà fisica di una membrana biologica, in quanto è uno dei parametri chiave per la regolazione dello stato morfologico e fisiologico delle cellule viventi. È noto che le membrane plasmatiche delle cellule tumorali presentano alterazioni significative nella composizione, nella struttura e nelle caratteristiche funzionali. Insieme al metabolismo disregolato del glucosio e dei lipidi, queste specifiche proprietà della membrana aiutano le cellule tumorali ad adattarsi al microambiente ostile e a sviluppare resistenza alle terapie farmacologiche. Qui, dimostriamo l'uso della microscopia a fluorescenza (FLIM) per visualizzare in sequenza il metabolismo cellulare e la viscosità della membrana plasmatica in colture di cellule tumorali vive. Le valutazioni metaboliche vengono eseguite rilevando la fluorescenza di cofattori metabolici endogeni, come la nicotinammide adenina dinucleotide ridotta NAD(P)H e le flavine ossidate. La viscosità viene misurata utilizzando un rotore molecolare fluorescente, un colorante sintetico sensibile alla viscosità, con una forte dipendenza dalla durata della fluorescenza dalla viscosità dell'ambiente circostante. In combinazione, queste tecniche ci consentono di comprendere meglio i legami tra lo stato della membrana e il profilo metabolico delle cellule tumorali e di visualizzare i cambiamenti indotti dalla chemioterapia.

Introduzione

La trasformazione maligna delle cellule è accompagnata da molteplici alterazioni del loro stato morfologico e fisiologico. La crescita rapida e incontrollata delle cellule tumorali richiede una riorganizzazione fondamentale delle vie biochimiche responsabili della produzione di energia e della biosintesi. I segni distintivi caratteristici del metabolismo del cancro sono l'aumento del tasso di glicolisi, anche sotto le normali concentrazioni di ossigeno (effetto Warburg), l'uso di aminoacidi, acidi grassi e lattato come combustibili alternativi, l'elevata produzione di ROS in presenza di alti livelli di antiossidanti e l'aumento della biosintesi degli acidi grassi 1,2. È ormai noto che il metabolismo delle cellule tumorali è altamente flessibile, il che consente loro di adattarsi all'ambiente sfavorevole ed eterogeneo e fornisce un ulteriore vantaggio di sopravvivenza3.

L'alterato metabolismo supporta l'organizzazione e la composizione specifica delle membrane delle cellule tumorali. Il profilo lipidico della membrana plasmatica nelle cellule tumorali differisce quantitativamente dalle cellule non cancerose. I principali cambiamenti nel lipidoma sono l'aumento del livello di fosfolipidi tra cui fosfatidilinositolo, fosfatidilserina, fosfatidiletanolammina e fosfatidilcolina, la diminuzione del livello di sfingomielina, l'aumento della quantità di colesterolo e un minor grado di insaturazione degli acidi grassi, per citarne alcuni 4,5,6. Pertanto, le proprietà fisiche della membrana, come la viscosità della membrana, l'inverso della fluidità, cambiano inevitabilmente. Poiché la viscosità determina la permeabilità delle membrane biologiche e controlla l'attività delle proteine associate alla membrana (enzimi, trasportatori, recettori), la sua regolazione omeostatica è vitale per il funzionamento cellulare. Allo stesso tempo, la modifica della viscosità attraverso l'aggiustamento del profilo lipidico di membrana è importante per la migrazione/invasione cellulare e la sopravvivenza in caso di cambiamenti condizionali.

La microscopia a fluorescenza con imaging a vita (FLIM) si è affermata come un potente approccio per la valutazione non invasiva di più parametri nelle cellule viventi, utilizzando la fluorescenza endogena o le sonde esogene7. FLIM è comunemente realizzato su un microscopio a scansione laser multifotone, che fornisce una risoluzione (sub)cellulare. Essendo dotato del modulo di conteggio di singoli fotoni correlato al tempo (TCSPC), consente misurazioni della fluorescenza risolte nel tempo con elevata precisione8.

L'indagine sul metabolismo cellulare mediante FLIM si basa sulla misurazione della fluorescenza di cofattori endogeni delle deidrogenasi, della nicotinammide adenina dinucleotide (fosfato) NAD(P)H ridotta e delle flavine ossidate - flavina adenina dinucleotide FAD e flavina mononucleotide FMN, che agiscono come trasportatori di elettroni in una serie di reazioni biochimiche 7,9,10. La fluorescenza rilevata di NAD(P)H proviene dal NADH e dalla sua forma fosforilata, NADPH, poiché sono spettralmente quasi identici. Tipicamente, i decadimenti di fluorescenza del NAD(P)H e delle flavine si adattano a una funzione bi-esponenziale. Nel caso del NAD(P)H, il primo componente (~0,3-0,5 ns, ~70%-80%) è attribuito al suo stato libero, associato alla glicolisi, e il secondo componente (~1,2-2,5 ns, ~20%-30%) al suo stato legato alle proteine, associato alla respirazione mitocondriale. Nel caso delle flavine, la componente corta (~0,3-0,4 ns, ~75%-85%) può essere assegnata allo stato spento del FAD e la componente lunga (~2,5-2,8 ns, ~15%-25%) al FAD non estinto, alla FMN e alla riboflavina. Alterazioni nei livelli relativi di glicolisi, glutamminolisi, fosforilazione ossidativa e sintesi degli acidi grassi provocano cambiamenti nelle frazioni di breve e lunga vita dei cofattori. Inoltre, il rapporto di intensità della fluorescenza di questi fluorofori (il rapporto redox) riflette lo stato redox cellulare ed è anche usato come indicatore metabolico. Sebbene il rapporto redox presenti una metrica più semplice, rispetto al tempo di vita della fluorescenza, in termini di acquisizione dei dati, FLIM è vantaggioso per stimare NAD(P)H e FAD, perché il tempo di vita della fluorescenza è una caratteristica intrinseca del fluoroforo e quasi non è influenzato da fattori come il potere di eccitazione, il fotosbiancamento, la messa a fuoco, la diffusione e l'assorbimento della luce, specialmente nei tessuti, a differenza dell'intensità dell'emissione.

Uno dei modi convenienti per mappare la viscosità nelle cellule e nei tessuti viventi a livello microscopico si basa sull'uso di rotori molecolari fluorescenti, piccoli coloranti sintetici sensibili alla viscosità, in cui i parametri di fluorescenza dipendono fortemente dalla viscosità locale11,12. In un mezzo viscoso, la durata di fluorescenza del rotore aumenta a causa del rallentamento della torsione o rotazione intramolecolare. Tra i rotori molecolari, i derivati del boro dipirromete (BODIPY) sono adatti per rilevare la viscosità nei sistemi biologici in quanto hanno un buon intervallo dinamico di tempi di vita della fluorescenza in un intervallo fisiologico di viscosità, indipendenza dalla temperatura, decadimenti di fluorescenza monoesponenziali che consentono una semplice interpretazione dei dati, sufficiente solubilità in acqua e bassa citotossicità13,14. Valutazioni quantitative della microviscosità utilizzando rotori a base di BODIPY e FLIM sono state precedentemente dimostrate su cellule tumorali in vitro, sferoidi tumorali multicellulari e tumori di topo in vivo15,16.

Qui, presentiamo una descrizione dettagliata delle metodologie di sondaggio sequenziale per lo studio del metabolismo cellulare e della viscosità della membrana plasmatica nelle cellule tumorali in vitro mediante FLIM. Per evitare la contaminazione della fluorescenza endogena relativamente debole con la fluorescenza del rotore basato su BODIPY, l'imaging dello stesso strato di cellule viene eseguito in sequenza con la fluorescenza di NAD(P)H e FAD prima visualizzata. La durata di fluorescenza dei cofattori viene misurata nel citoplasma e la durata di fluorescenza del rotore viene misurata nelle membrane plasmatiche delle cellule mediante la selezione manuale delle zone corrispondenti come regioni di interesse. Il protocollo è stato applicato per correlare lo stato metabolico e la viscosità per diverse linee cellulari tumorali e per valutare i cambiamenti dopo la chemioterapia.

Il protocollo per la preparazione dei campioni FLIM non differisce da quello per la microscopia a fluorescenza confocale. Una volta acquisiti i dati, il compito principale è quello di estrarre il tempo di vita della fluorescenza dai dati grezzi. Le prestazioni del protocollo sono dimostrate utilizzando cellule HCT116 (carcinoma colorettale umano), CT26 (carcinoma del colon murino), HeLa (carcinoma cervicale umano) e huFB (fibroblasti della pelle umana).

Protocollo

1. Descrizione della configurazione minima per eseguire FLIM

  1. Per eseguire questo esperimento, assicurarsi che sia disponibile la configurazione richiesta: un microscopio confocale invertito, un laser pulsato, tipicamente un ps o fs, con il segnale di sincronizzazione, un rivelatore di conteggio dei fotoni veloce (risposta temporale 150 ps) e un'elettronica di conteggio dei fotoni, porte di uscita e di ingresso disponibili per il rivelatore e il laser, rispettivamente, sul microscopio, gli impulsi dell'orologio di scansione dal controller di scansione del microscopio, la testa di scansione del microscopio con i combinatori di raggi laser e i principali dicroici beam splitter adatti alla lunghezza d'onda del laser utilizzato per FLIM.
  2. Se per FLIM si utilizza l'eccitazione a due fotoni, assicurarsi che il microscopio contenga la porta NDD.
  3. Per gli studi sulle cellule di mammifero, in particolare per gli esperimenti a lungo termine, assicurarsi di mantenere un incubatore di CO2 alla temperatura desiderata.
    NOTA: Per il sistema utilizzato in questo esperimento, vedere Tabella dei materiali.

2. Preparazione delle cellule per la microscopia

  1. Far crescere le cellule regolarmente in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 e un'atmosfera umida.
  2. Per la microscopia, preparare la sospensione cellulare in un terreno di coltura completo alla concentrazione di 1 x 106 cellule/mL.
    NOTA: Le concentrazioni delle celle e le condizioni dei mezzi dipendono dalle cellule. Il numero di cellule utilizzate per la semina e il tempo di incubazione devono essere adattati per ottenere una confluenza del 70%-80% nel piatto microscopico.
  3. Seminare le cellule su piastre per colture cellulari da 35 mm con fondo di vetro (1 x 10,5 cellule in 100 μl per piastra) utilizzando una pipetta automatica da 200 μl.
    NOTA: Utilizzare piastre con fondo di vetro a griglia per la semina delle cellule per monitorare le cellule negli stessi campi microscopici visivi in dinamica.
    1. Durante la semina manuale, assicurarsi che la punta della pipetta non graffi il fondo o i lati della piastra per evitare di danneggiare il fondo.
  4. Posizionare la capsula nell'incubatore di CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera umida) e incubare le cellule per 24 ore.
  5. Dopo 24 ore, rimuovere la capsula dall'incubatrice e controllare la morfologia e la confluenza delle cellule al microscopio ottico. Se le cellule non hanno raggiunto circa l'80% di confluenza, incubare per altre 24 ore.
  6. Rimuovere delicatamente il vecchio terreno dalla piastra utilizzando una pipetta automatica da 1.000 μl e aggiungere 2 mL di terreno DMEM senza rosso fenolo (ad esempio, DMEM Life o FluoroBrite).
    NOTA: Per l'imaging è possibile utilizzare diversi terreni di coltura. Evitare il rosso fenolo nel terreno quando si utilizzano le cellule per la microscopia.
  7. Mettere il piatto nell'incubatrice per 60-120 minuti per consentire l'adattamento delle cellule.

3. FLIM dei cofattori metabolici

  1. Posizionare il piatto con fondo di vetro con le cellule (dal passaggio 2.7) sul tavolino del microscopio.
  2. Fare clic sulla scheda Localizza nel software del microscopio a scansione laser (ad esempio, ZEN - ZEISS Efficient Navigation), quindi fare clic su Luce di trasmissione (TL) per accendere la luce.
  3. Trova il piano focale del campione osservandolo attraverso l'oculare a livello della fetta centrale delle celle, dove un quadrato è occupato al massimo dalle celle (con ingrandimento 40x).
  4. Fare clic sul pulsante OFF per spegnere la luce.
  5. Apri la scheda Acquisizione . Per ottenere immagini di intensità di trasmissione e autofluorescenza di NAD(P)H endogeno, inserire le seguenti impostazioni: Lunghezza d'onda di eccitazione: modalità a due fotoni 750 nm, Intervallo di registrazione: 450-490 nm, Potenza laser: 5% (~6 mW), Dimensioni dell'immagine: 1024 x 1024 pixel.
    NOTA: La scelta della lunghezza d'onda di eccitazione e dell'intervallo di registrazione si basa sulle caratteristiche spettrali (massima eccitazione e massima emissione) di NAD(P)H17.
    1. Per l'acquisizione dell'immagine utilizzare un obiettivo a immersione in olio С Plan-Apochromat 40x/1,3 NA.
  6. Premere il pulsante Snap e salvare l'immagine in formato ZEN.
  7. Per ottenere le immagini di trasmissione e intensità di autofluorescenza del FAD, modificare la lunghezza d'onda di eccitazione a 900 nm. Impostare l'intervallo di registrazione: 500-550 nm, la potenza del laser: 9% (~6 mW) e la dimensione dell'immagine: 1024 x 1024 pixel.
    NOTA: La scelta della lunghezza d'onda di eccitazione e dell'intervallo di registrazione si basa sulle caratteristiche spettrali (massima eccitazione e massima emissione) del FAD18.
    1. Per l'acquisizione delle immagini utilizzare un obiettivo a immersione in olio С Plan-Apochromat 40x/1,3 NA.
  8. Premere il pulsante Snap e salvare l'immagine in formato ZEN.
  9. Per NAD(P)H, impostare i parametri come descritto al punto 3.5 nel software del microscopio a scansione laser. Modificare la dimensione dell'immagine a 256 x 256 pixel.
  10. Inserire i seguenti parametri nel menu del software operativo SPCM (Single Photon Counting Modules) del modulo FLIM: Tempo di raccolta: 60 s; Gamma TAC: 5.00E-8; Limite CFD basso: -29.41; Risoluzione ADC: 256, Dimensione immagine: 256 x 256 pixel.
  11. Scansiona il campione per 60 s, interrompi la scansione e salva l'immagine FLIM ottenuta di NAD(P)H.
  12. Controllare i dati FLIM ottenuti. Per questo, apri i dati grezzi nel software di immagine, seleziona un pixel nel citoplasma della cellula posizionando il cursore su di esso e analizza il decadimento della fluorescenza in questo pixel. L'intensità dei pixel dovrebbe essere di ≥3.000 fotoni per curva di decadimento al binning 1.
    NOTA: Se il numero di fotoni è inferiore a 3.000, aumentare la potenza del laser o il tempo di raccolta delle immagini, controllando la morfologia delle celle e la velocità di conteggio dei fotoni. In genere, se il calo del tasso di conteggio supera il 10% del valore iniziale, si verifica il fotosbiancamento.
  13. Per FAD, impostare i parametri come descritto al punto 3.7 nel software del microscopio a scansione laser. Cambia le dimensioni dell'immagine a 256 x 256 pixel.
  14. Inserire i seguenti parametri nel menu del software operativo SPCM (Single Photon Counting Modules) del modulo FLIM: Tempo di raccolta: 60 s; Gamma TAC: 5.00E-8; Limite CFD basso: -29.41; Risoluzione ADC: 256, Dimensione immagine: 256 x 256 pixel.
  15. Scansiona il campione per 60 s. Interrompere la scansione e salvare l'immagine FLIM ottenuta di FAD.
    NOTA: I parametri indicati nei passaggi 3.10 e 3.15 sono specifici per l'elettronica e il rivelatore utilizzato.
  16. Controllare i dati ottenuti come descritto nel passaggio 3.12.
  17. Ripetere i passaggi 3.5-3.16 per registrare immagini FLIM da diversi campi visivi.

4. Colorazione delle cellule con il rotore molecolare fluorescente

NOTA: Le celle vengono visualizzate nella soluzione fluorescente del rotore molecolare senza lavaggio a temperatura ambiente (~20 °C) per rallentare l'internalizzazione del rotore. La viscosità della membrana dipende dalla temperatura, come dimostrato nei nostri precedenti lavori19,20. Il tavolino a temperatura controllata del microscopio deve essere spento in anticipo, cioè prima che il rotore venga aggiunto alle celle. Per la nostra configurazione, il raffreddamento del palco richiede circa 10 minuti.

  1. Preparare una soluzione madre generale del rotore molecolare fluorescente BODIPY 2 (Stock 1, 25,7 mM).
    1. Aprire BODIPY 2 in un ambiente sterile e pesare circa 2 mg, utilizzando una bilancia accurata. Posizionarlo con cura in una provetta da microcentrifuga.
    2. Utilizzare una pipetta automatica da 20 μl per aggiungere 3 μl di un solvente adatto (ad es. DMSO).
    3. Una volta che il campione si è completamente sciolto nel DMSO, aggiungere 297 μL di PBS sterile e mescolare accuratamente utilizzando una pipetta automatica da 200 μL.
      NOTA: Conservare la soluzione madre in frigorifero a +4 °C in confezione scura. Una volta risospeso, può essere conservato in frigorifero per diversi mesi.
  2. Preparare uno Stock 2 (8,9 mM) aggiungendo 25 μL della soluzione madre generica (Stock 1) a una provetta per microcentrifuga, seguiti da 48 μL di PBS sterile. Miscelare delicatamente utilizzando una pipetta automatica da 200 μl.
    NOTA: Utilizzare il materiale di produzione 2 per preparare il materiale di colorazione finale, che viene applicato per la colorazione cellulare poiché è richiesta la concentrazione micromolare.
  3. Riposizionare delicatamente il terreno di coltura nella piastra (dal passaggio 3.1) con una soluzione di Hank ghiacciata senza Ca2+/Mg2+ e incubare le cellule a +4 °C per 3 minuti.
    NOTA: L'uso di una soluzione ghiacciata e l'incubazione a +4 °C rallenta l'internalizzazione del rotore molecolare e la colorazione locale della membrana persiste per 20-30 minuti.
  4. Preparare la soluzione colorante finale contenente 4,5 μM di BODIPY 2 aggiungendo 1 μL di Stock 2 a 999 μL di soluzione di Hank ghiacciata o PBS.
    NOTA: La concentrazione di BODIPY 2 nella soluzione di colorazione finale può essere aumentata a ~10 μM senza effetti tossici sulle cellule, il che si traduce in una colorazione più efficiente e in un maggior numero di fotoni raccolti. A concentrazioni più elevate, può verificarsi un sovraccarico del rivelatore FLIM.
  5. Aspirare la soluzione di Hank dalla piastra di coltura cellulare e sostituirla con una soluzione ghiacciata da 4,5 μM di BODIPY 2. Le cellule vengono visualizzate in soluzione BODIPY 2 senza lavaggio.

5. FLIM del rotore molecolare fluorescente nelle cellule

NOTA: Eseguire sempre la FLIM del rotore molecolare fluorescente dopo la FLIM dei cofattori metabolici perché lo spettro di fluorescenza di BODIPY 2 è sovrapposto all'emissione di cofattori endogeni NAD(Р)H e FAD 12,17,18.

  1. Trasferire la piastra con le cellule colorate sul tavolino del microscopio (~20 °C) per l'imaging.
  2. Impostare i seguenti parametri per la modalità a un fotone nel software del microscopio a scansione laser: Eccitazione alla lunghezza d'onda di 488 nm con un laser a ioni argon, Potenza laser 1%-2%, intervallo di registrazione 500-550 nm lunghezza d'onda.
  3. Per l'acquisizione delle immagini utilizzare un obiettivo a immersione in olio С Plan-Apochromat 40x/1,3 NA.
  4. Premere il pulsante Live . Avvia la scansione e utilizza il posizionamento XY e Z tramite un tavolino motorizzato integrato, regola la messa a fuoco e ottieni immagini di trasmissione e intensità di fluorescenza delle cellule in una finestra di anteprima. Salvare le immagini ottenute, se necessario.
  5. Controllare l'immagine di trasmissione e fluorescenza sovrapposta per vedere se la fluorescenza del rotore proviene dalla posizione prevista (membrana plasmatica della cellula).
  6. Inserire i seguenti parametri nel menu del software SPCM del modulo FLIM: Tempo di raccolta: 60 s; Gamma TAC: 5.00E-8; Limite CFD basso: -29.41; Risoluzione ADC: 256, Dimensione immagine: 256 x 256 pixel.
    NOTA: A seconda della configurazione del sistema e dei rilevatori utilizzati per FLIM, i parametri di acquisizione delle immagini possono variare.
  7. Regolare il laser Ti:Sapphire del microscopio su una lunghezza d'onda di 850 nm e la potenza del laser su 1%-2% per FLIM a due fotoni.
  8. Selezionare la scheda Continua nel software del microscopio a scansione laser, quindi premere Avvia nel software SPCM. Scansiona il campione per 60 s, interrompi la scansione e salva l'immagine FLIM ottenuta.
  9. Controllare i dati FLIM ottenuti. A tal fine, caricare i dati grezzi nel software SPCImage per l'analisi dei dati FLIM, selezionare un pixel nella membrana della cella posizionando il cursore su di esso e analizzare il decadimento della fluorescenza in questo pixel. L'intensità dei pixel dovrebbe essere di ≥5.000 per decadimento (possibilmente includendo il binning) a un tempo di raccolta ragionevole (60-120 s).
  10. Ripetere i passaggi 5.4-5.8 per registrare le immagini FLIM delle celle da diversi campi visivi.
    NOTA: Le misurazioni FLIM di cellule vive colorate con BODIPY 2 devono essere limitate a ~30 minuti dopo l'aggiunta di BODIPY 2.

6. Analisi dei dati

  1. Analisi dell'intensità della fluorescenza: rapporto redox
    1. Apri le immagini dell'intensità di fluorescenza di NAD(P)H e FAD utilizzando ImageJ.
    2. Evidenziate un'area priva di celle nell'immagine NAD(P)H utilizzando un'opzione circolare o quadrata. Fare clic su Misura, quindi fare clic su Sottrai (selezionare Elabora nel pannello principale, quindi Matematica e sottrai) per sottrarre il valore ottenuto del segnale di fondo.
    3. Ripetere il passaggio 6.1.2 per l'immagine FAD.
    4. Ottenere l'immagine del rapporto redox dividendo l'intensità di fluorescenza FAD per l'intensità di fluorescenza NAD(P)H. Fallo selezionando Elabora nel pannello principale, quindi seleziona Calcolatrice immagini e Dividi; selezionare la casella Crea nuova finestra, quindi premere OK.
    5. Salva l'immagine in formato TIFF.
    6. Per calcolare il rapporto redox, selezionare la regione del citoplasma nella cellula specifica sull'immagine TIFF e premere il tasto M . Ripetere l'operazione per tutte le celle di interesse.
    7. Importa la misurazione in un foglio di calcolo.
      NOTA: In alternativa, le intensità di fluorescenza di NAD(P)H e FAD nelle cellule possono essere misurate utilizzando il software standard del microscopio e il rapporto redox può essere ottenuto dividendo questi valori nel software del foglio di calcolo.
  2. Analisi dei dati FLIM: metabolismo
    1. Importa l'immagine FLIM di NAD(P)H nel software SPCImage.
    2. Applica un adattamento di decadimento bi-esponenziale all'immagine inserendo 2 nella sezione Componenti .
    3. Correggi il parametro Offset selezionando la casella corrispondente nel software SPCImage.
    4. Vai su Opzioni e seleziona Modello. Utilizzare il modello di fitting multiesponenziale incompleto e il metodo di adattamento MLE.
    5. Regola il binning per ottenere intensità di pixel di ≥5000 fotoni per curva di decadimento.
    6. Controllare il valore χ2. Il χ2≤ 1,20 indica che il modello utilizzato fornisce un adattamento ragionevole.
    7. Calcola l'istogramma del tempo di vita della fluorescenza in ogni immagine cliccando sul menu in alto Calcola, e poi su Matrice di decadimento.
    8. Selezionare l'area nel citoplasma della cellula specifica come regione di interesse.
    9. Analizza i componenti di durata breve e lunga (τ1 e τ2, rispettivamente) e le ampiezze relative dei componenti di durata (a1 e a2, dove a1 + a2 = 100%) utilizzando l'opzione Colore .
    10. Esporta le misurazioni in un software per fogli di calcolo.
    11. Ripetere i passaggi 6.2.8-6.2.10 per ogni cella di interesse.
    12. Ripetere i passaggi 6.2.1-6.2.11 per l'immagine FAD.
  3. Analisi dei dati FLIM: viscosità
    1. Importa l'immagine FLIM nel software SPCImage per l'analisi dei dati FLIM.
    2. Rimuovere il segno nella casella Scatter .
    3. Metti 1 nella sezione Componenti , poiché il decadimento della fluorescenza del rotore dovrebbe adattarsi a un modello monoesponenziale.
    4. Regola il binning per ottenere un'intensità di pixel di ≥5000 fotoni per curva di decadimento.
    5. Controllare il valore χ2 nella membrana plasmatica. Un valore di χ2≤ 1,20 indica che il modello utilizzato fornisce un adattamento ragionevole. Nel caso di χ2≥ 1,20, l'approssimazione monoesponenziale non è applicabile, tali dati possono indicare l'aggregazione del colorante e devono essere scartati. L'aggregazione rende impossibile l'utilizzo delle curve di calibrazione e porta a stime di viscosità errate.
      NOTA: I decadimenti biesponenziali possono essere indicativi di aggregazione. Su un microscopio con modulo FLIM con filtri variabili, questo può essere rilevato testando gli intervalli di lunghezze d'onda di emissione specifici del monomero e dell'aggregato, 500-550 nm e 580-650 nm, come descritto nel riferimento21.
    6. Genera l'istogramma del tempo di vita della fluorescenza τ per ogni immagine cliccando sul menu in alto Calcola, e poi su Matrice di decadimento.
    7. Selezionare la regione della membrana plasmatica di una singola cellula con decadimento monoesponenziale, χ2≤ 1,20, utilizzando l'opzione ROI.
    8. Esporta il valore della durata della fluorescenza in un software per fogli di calcolo.
    9. Ripetere i passaggi 6.3.7-6.3.8 per ogni cella di interesse.
    10. Convertire i tempi di vita misurati sperimentalmente di BODIPY 2 (in ns) in valori di viscosità (in cP) utilizzando la seguente equazione (precedentemente ottenuta sulla base del grafico di calibrazione di BODIPY in miscele di metanolo/glicerolo):
      figure-protocol-19095
      dove x - viscosità (in cP), y - durata di vita della fluorescenza τ (in ns).
      NOTA: IRF (Instrument Response Function) è una parte importante del fitting FLIM. In SPCImage l'IRF viene calcolato automaticamente dal fronte di salita delle curve di decadimento della fluorescenza. Nel frattempo, l'IRF può essere registrato utilizzando un campione non fluorescente, ad esempio ceramiche, o un campione che produce un segnale SHG (Second Harmonic Generation), ad esempio collagene, cristalli di urea o zucchero. L'uso degli IRF registrati non è raccomandato se nel software è disponibile un'opzione per calcolarli.

Risultati

Utilizzando il protocollo qui descritto, abbiamo visualizzato i cofattori metabolici e la viscosità microscopica della membrana in cellule vive in coltura utilizzando FLIM. Le misurazioni sono state effettuate in diverse linee cellulari tumorali: carcinoma colorettale umano HCT116, carcinoma del colon murino CT26, carcinoma cervicale umano HeLa Kyoto e fibroblasti cutanei umani huFB.

Il rapport...

Discussione

Questo protocollo illustra le possibilità di FLIM per l'analisi multiparametrica, funzionale e biofisica delle cellule tumorali. La combinazione dell'imaging metabolico ottico basato sulla fluorescenza endogena e delle misure della viscosità della membrana plasmatica mediante marcatura esogena con rotore molecolare fluorescente ci consente di caratterizzare le interconnessioni tra questi due parametri in cellule tumorali vive in una coltura cellulare e di seguire i cambiamenti in rispo...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Lo sviluppo del protocollo di imaging metabolico è stato supportato dal Ministero della Salute della Federazione Russa (Incarico governativo, registrazione n. АААА-А0-120022590098-0). Lo studio della viscosità è stato sostenuto dalla Russian Science Foundation (Progetto n. 20-14-00111). Gli autori sono grati ad Anton Plekhanov (PRMU) per il suo aiuto nella produzione video.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Item/Device
Cell culture incubatorSanyo37°C, 5% CO2, humidified atmosphere
Centrifuge 5702 REppendorf5703000010
imageJ 1.53cWayne Rasband (NIH)
FLIM module Simple Tau 152 TCSPC (in LSM 880)Becker & Hickl GmbH
Laminar flow hoodThermoFisher Scientific
Leica microscope DFC290Leica Microsystems
LSM 880 confocal microscopeCarl Zeiss
Ti:Sapphire femtosecond laser Mai TaiSpectra Physics
Microscope incubator XLmulti S DARK LSPeCon GmbH273-800 050
Mechanical pipettorSartorius mLINEvolume 0.5-10 μL; 20-200 μL; 100-1000 μL
Oil-immersion objective C-Apochromat 40×/1.2 NA W Korr  (in LSM 880)Carl Zeiss421767-9971-790
Power-Tau 152 module with the detector HPM-100-40Becker&Hickl GmbH
SPCImage softwareBecker & Hickl GmbHSPC 9.8; SPCImage 8.3
ZEN softwareCarl ZeissZEN 2.1 SP3 (black), Version 14.0.0.201
Reagent/Material
5-fluorouracilMedac GmbH3728044
DMEMGibco, Life Technologies31885023
DMSOPanEcoF135
FBSHycloneA3160801
FluoroBright DMEMGibco, Life TechnologiesA1896701
Hank’s solution without Ca2+/Mg2+Gibco, Life Technologies14175
l-GlutaminePanEcoF032
Mammalian cellsHCT116, CT26, HeLa Kyoto, huFB
Molecular rotor BODIPY 2Synthesized and Supplied by Marina Kuimova Group, Imperial College London
Penicillin/streptomycinPanEcoA065
Tissue culture dish with cover glass-bottom FluoroDishesWorld Precision Instruments, Inc
Trypsin- EDTA 0.25%PanEcoP034
Versen bufferPanEcoR080p

Riferimenti

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