Un modello gut-on-a-chip per studiare l'asse microbioma intestinale-sistema nervoso

Riepilogo

neuroHuMiX è un modello avanzato gut-on-a-chip per studiare le interazioni di cellule batteriche, epiteliali e neuronali in condizioni di co-coltura prossimali e rappresentative. Questo modello permette di svelare i meccanismi molecolari alla base della comunicazione tra il microbioma intestinale e il sistema nervoso.

Abstract

Il corpo umano è colonizzato da almeno lo stesso numero di cellule microbiche che è composto da cellule umane, e la maggior parte di questi microrganismi si trova nell'intestino. Sebbene l'interazione tra il microbioma intestinale e l'ospite sia stata ampiamente studiata, il modo in cui il microbioma intestinale interagisce con il sistema nervoso enterico rimane in gran parte sconosciuto. Ad oggi non esiste un modello in vitro fisiologicamente rappresentativo per studiare le interazioni microbioma intestinale e sistema nervoso.

Per colmare questa lacuna, abbiamo ulteriormente sviluppato il modello gut-on-chip di diafonia uomo-microbica (HuMiX) introducendo neuroni enterici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte nel dispositivo. Il modello risultante, "neuroHuMiX", consente la co-coltura di cellule batteriche, epiteliali e neuronali attraverso canali microfluidici, separati da membrane semipermeabili. Nonostante la separazione dei diversi tipi di cellule, le cellule possono comunicare tra loro attraverso fattori solubili, fornendo contemporaneamente l'opportunità di studiare ogni tipo di cellula separatamente. Questa configurazione consente di ottenere le prime informazioni su come il microbioma intestinale influisce sulle cellule neuronali enteriche. Questo è un primo passo fondamentale nello studio e nella comprensione dell'asse microbioma intestinale umano-sistema nervoso.

Introduzione

Il microbioma intestinale umano svolge un ruolo cruciale nella salute e nelle malattie umane. È stato ampiamente studiato nell'ultimo decennio e mezzo e il suo potenziale ruolo nella modulazione della salute e della malattia è^{ora stabilito}. È stato ipotizzato che un'interruzione del microbioma che porta a una comunità microbica squilibrata (disbiosi) sia coinvolta nella patogenesi di molti disturbi cronici, come l'obesità, le malattie infiammatorie intestinali e il cancro del colon-retto, o anche malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson ^2,3.

Sebbene il microbioma intestinale umano sia stato associato a condizioni neurologiche, non è ancora chiaro come il microbioma intestinale comunichi e influenzi il sistema nervoso enterico. Poiché il sistema nervoso enterico umano non è facilmente accessibile per uno studio immediato, finora sono stati utilizzati modelli animali negli esperimenti⁴. Tuttavia, date le apparenti differenze tra i modelli animali e gli esseri umani⁵, lo sviluppo di modelli in vitro che imitano l'intestino umano è di immediato interesse. In questo contesto, il fiorente e avanzato campo delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) ci ha permesso di ottenere neuroni enterici (^EN) rappresentativi6. Le EN derivate da iPSC consentono lo studio del sistema nervoso enterico in modelli di coltura in vitro, come inserti per colture cellulari, organoidi o organs-on-a-chip ^7,8.

Il modello di diafonia uomo-microbico (HuMiX) è un modello gut-on-a-chip che imita l'intestino umano⁹. Il modello iniziale di HuMiX (di seguito denominato dispositivo iniziale) ospitava cellule epiteliali (Caco-2) e cellule batteriche^10,11. Tuttavia, per studiare il legame tra microbioma intestinale e sistema nervoso, sono state introdotte nel sistema anche ENs⁶ derivate da iPSC (Figura 1). La co-coltura prossimale di cellule neuronali, epiteliali e batteriche permette l'analisi dei diversi tipi cellulari singolarmente e lo studio delle interazioni tra i diversi tipi cellulari in un ambiente che imita quello dell'intestino umano.

Negli ultimi anni, sono stati fatti progressi nello sviluppo di modelli per studiare gli organi in modi più fisiologicamente rappresentativi, utilizzando modelli organs-on-a-chip (ad esempio, gut-on-a-chip). Questi modelli sono più rappresentativi dell'ambiente intestinale umano grazie al costante apporto di nutrienti e alla rimozione dei rifiuti, nonché al monitoraggio in tempo reale, ad esempio, dei livelli di ossigeno o dell'integrità della barriera ^8,12. Questi modelli consentono in particolare lo studio degli effetti dei batteri intestinali sulle cellule ospiti. Tuttavia, per essere in grado di utilizzare gli organi su un chip per studiare le interrelazioni tra il microbioma intestinale e il sistema nervoso, le cellule neuronali devono essere integrate in tali sistemi. Pertanto, l'obiettivo dell'ulteriore sviluppo di HuMiX e della creazione del sistema neuroHuMiX (di seguito denominato dispositivo) era quello di sviluppare un modello gut-on-a-chip, che include cellule neuronali enteriche in co-coltura prossimale con cellule epiteliali intestinali e batteri.

Protocollo

1. Coltura cellulare e cernita

1. Neuroni enterici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte
   NOTA: Coltivare le iPSC 6 settimane prima dell'inizio di una corsa. Il protocollo di differenziazione per le EN è stato adattato da Fattahi et ^al.6.
   1. Coltura delle iPSC su una piastra a 6 pozzetti rivestita di gel in 2 ml/pozzetto di terreno di coltura iPSC integrato con penicillina-streptomicina (P/S) all'1%.
   2. All'80%-90% di confluenza, far passare le cellule, seminare in una piastra rivestita di gel a matrice utilizzando lo stesso terreno, incubare a 37 °C, 5% di CO₂ e 90% di umidità relativa (RH).
   3. Per la derivazione delle iPSC, dopo due passaggi dopo lo scongelamento, all'80%-90% di confluenza, seminare le cellule in una piastra a 6 pozzetti rivestita di gel a matrice con una densità di 100.000 cellule/pozzetto. Incubare nel terreno sopra descritto + inibitore ROCK Y-27632 (1:2.000) per 24 ore a 37 °C.
   4. Dopo 24 ore, sostituire il terreno surnatante con il terreno del giorno 0, secondo la Tabella 1. Includere un pozzetto di controllo da utilizzare come controllo negativo durante l'ordinamento delle cellule per il processo di derivazione. Mantenere bene il controllo nella composizione del terreno del giorno 0 per l'intero periodo di derivazione. Cambiare il mezzo a giorni alterni dal giorno 2 al giorno 10, secondo la Tabella 1.
   5. Il giorno 11, ordinare le cellule per le cellule CD49d-positive, che verranno utilizzate nei passaggi successivi di questo protocollo.
      1. Raggruppare le cellule da ordinare in base alle cellule CD49d-positive, nonché il pozzetto di controllo. Centrifugare le cellule per 3 minuti a 300 × g. Risospendere il pellet cellulare in albumina sierica bovina al 2% (BSA) + 1% P/S in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
      2. Dividi ogni lotto di cellule (raggruppate e di controllo) in due: colora una frazione con l'anticorpo anti-CD49d umano e l'altra frazione con un anticorpo di controllo dell'isotipo.
      3. Gate la popolazione cellulare principale e poi gate le singole cellule, in base alle quali verranno selezionate le cellule che presentano CD49d sulla loro superficie. Raccogli queste cellule per la fase successiva della differenziazione.
         NOTA: Di solito, il 30%-40% delle cellule ordinate sono CD49d-positive.
   6. Trasferire da due a quattro milioni di cellule selezionate in una piastra a 6 pozzetti di una piastra a bassissimo attacco in terreni N2B27 (vedere Tabella 2) + FGF2 + CHIR per 4 giorni per consentire la formazione di sferoidi.
   7. Il giorno 15, riplaccare gli sferoidi su una piastra a 6 pozzetti rivestita di poli-L-ornitina/laminina/fibronectina (P/L/F) in 2 ml/pozzetto di terreno N2B27 con GDNF e acido ascorbico (AA). Sostituire il mezzo ogni 2-3 giorni.
      NOTA: Rapporto di rivestimento: poli L-ornitina, 15 μg/mL; laminina, 2 μg/mL; fibronectina, 2 μg/mL in 1x PBS.
   8. Dopo 3 settimane, utilizzare le cellule per l'inoculazione nel dispositivo.
2. Caco-2
   NOTA: Scongelare le cellule Caco-2 almeno 1 settimana prima di una corsa.
   1. Seminare un pallone T75 con 1 × 10⁶ cellule Caco-2 in integratore di glutammina RPMI 1640 + HEPES + 10% di siero fetale bovino (FBS); incubare a 37 °C, 5% di CO₂ e 90% di umidità relativa.
      NOTA: Per questi esperimenti, utilizzare idealmente Caco-2 al primo o al secondo passaggio dopo lo scongelamento.

2. Preparazione della corsa HuMiX

1. Preparazione e rivestimento del coperchio in policarbonato
   1. Sterilizzare in autoclave una coppia di coperchi in policarbonato (PC) (Figura 2) insieme a quattro viti utilizzando il ciclo iniziale dello strumento del dispositivo (vedere la Tabella 3 per i dettagli).
   2. In una cabina di biosicurezza, inserire quattro viti in ciascun angolo del coperchio inferiore del PC (vedere la Figura 3) e trasferire in una capsula di Petri quadrata sterile per un processo di rivestimento in due fasi.
      1. Il primo giorno, aggiungere 2 ml di poli-ornitina all'1,5% in PBS (1x) al centro del coperchio del PC. Incubare per una notte a 37 °C, 5% di CO₂ e 90% di umidità relativa.
      2. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione e sostituirla con una soluzione contenente lo 0,2% di laminina e lo 0,2% di fibronectina in PBS (1x) per coprire la superficie della camera cellulare neuronale. Incubare il coperchio per una notte a 37 °C, 5% di CO₂ e 90% di umidità relativa.
   3. Dopo l'incubazione, tenere la soluzione di rivestimento sul coperchio del PC e chiudere la capsula di Petri con una pellicola sigillante. Collocarli a 4 °C per la conservazione fino al momento dell'uso.
   4. Prima dell'uso, rimuovere la soluzione di rivestimento e asciugare all'aria in una cabina di sicurezza biologica per 30 minuti fino a quando il rivestimento non è completamente asciutto.
2. Preparazione e rivestimento della guarnizione
   NOTA: Questa sezione descrive come preparare le guarnizioni incollando membrane semipermeabili alle guarnizioni in silicone. Dopo una prima fase di sterilizzazione in autoclave, le guarnizioni vengono rivestite con collagene o mucina per consentire l'adesione di cellule epiteliali intestinali o batteri. La membrana rivestita di mucina imita la barriera di muco presente nell'intestino umano.
   1. Collegare una membrana in policarbonato con pori da 1 μm alla guarnizione in collagene e una membrana in policarbonato con pori da 50 nm tra le guarnizioni sandwich inferiore e superiore. Autoclavare le guarnizioni con le membrane attaccate utilizzando il ciclo iniziale dello strumento del dispositivo (vedi Tabella 3).
   2. Per rivestire le membrane, posizionare ciascuna guarnizione in un piatto quadrato sterile.
      NOTA: Il rivestimento viene eseguito in condizioni sterili in una cabina di biosicurezza.
      1. Per la guarnizione di collagene, aggiungere 3 mL di collagene (50 μg/mL) alla membrana e incubare per 3 ore a 37 °C.
         NOTA: Fare attenzione a non toccare la membrana con la punta della pipetta quando si aggiunge il collagene per evitare di danneggiare la membrana.
      2. Per il rivestimento della mucina, posizionare la guarnizione a sandwich con il lato superiore della guarnizione rivolto verso l'alto in una capsula di Petri per rivestire il lato superiore della membrana con 3 mL di mucina (0,025 mg/mL). Incubare le guarnizioni a 37 °C per 1 h.
   3. Trascorso il tempo di incubazione, aspirare le soluzioni di collagene e mucina dalle rispettive guarnizioni e asciugare la membrana all'aria in una cabina di biosicurezza per 30 minuti. Chiudere le stoviglie, sigillare con pellicola sigillante da laboratorio e conservare le guarnizioni a 4 °C fino all'uso.
3. Assemblaggio di tubi
   NOTA: Questa sezione descrive come assemblare il tubo per la perfusione del dispositivo. Prima dell'assemblaggio, sterilizzare in autoclave tutti i pezzi e/o acquistare quelli confezionati singolarmente in una confezione sterile. Collocare tutti i componenti in una cabina di biosicurezza.
   1. Utilizzare tre tubi per ciascun dispositivo e per ogni tubo tubolare, un pezzo di tubo della pompa, due pezzi di tubo Marprene lungo (20 cm), due pezzi di tubo Marprene corto (8 cm), un ago da 40 mm per il flacone di deflusso, un ago da 120 mm per i flaconi di afflusso da 250 ml o ago da 80 mm per i flaconi di afflusso più piccoli, tre connettori Luer a barb maschio e sette femmina, tre adattatori Luer e due valvole a rubinetto a tre vie.
   2. Assemblare le linee di tubi da sinistra a destra utilizzando i componenti sterilizzati e sterilizzati in autoclave sopra elencati (Figura 4).
      NOTA: Spruzzare ogni componente con etanolo al 70% tra ogni fase di connessione.
4. Preparazione dei supporti
   NOTA: Questa sezione descrive come preparare il terreno per i diversi tipi di cellule nel dispositivo, nonché come trasferire il terreno nei flaconi di siero in modo sterile.
   1. Supplemento RPMI 1640 con FBS filtrato al 10% da 0,22 μm e inattivato termicamente. Integrare i terreni N2B27 con GDNF e AA.
   2. Trasferire il terreno nei flaconi di siero in condizioni sterili. Trasferire 200 mL di terreno RPMI 1640 in flaconi da 250 mL e 30 mL di terreno N2B27 in flaconi da 50 mL.
      1. Preparare il terreno batterico (RPMI 1640 + 10% FBS + 5% terreno di coltura De Man, Rogosa e Shapre [MRS]) in una fase successiva, poiché ciò è necessario solo durante le ultime 24 ore dell'esperimento.
      2. Chiudere le bottiglie con un setto nasale, crimparle in alluminio e sterilizzarle in autoclave.
      3. Per trasferire il supporto, rimuovere la crimpatura in alluminio utilizzando un apposito decapsulatore (diametro = 20 mm). Rimuovere anche il setto. Versare con cautela il terreno preparato nei flaconi di siero senza toccare il flacone.
   3. Per sterilizzare, fiammare l'apertura del flacone utilizzando un bruciatore Bunsen portatile. Sigillare le bottiglie spruzzando il setto con etanolo al 70%, aggiungendolo alla bottiglia e chiudendola con una crimpatura di alluminio utilizzando una crimpatrice di tenuta.
   4. Mettere i flaconi chiusi nell'incubatore a 37 °C, 5% di CO₂ per 24 ore per riscaldare il terreno a 37 °C, nonché per assicurarsi che non vi siano segni visibili di contaminazione prima di utilizzare i flaconi di terreno per il dispositivo.

3. Avvio di HuMiX

1. Assemblaggio NeuroHuMiX
   NOTA: Questa sezione spiega come assemblare il dispositivo. In breve, il sistema di bloccaggio viene sterilizzato e ristretto, dopodiché il coperchio inferiore del PC viene posizionato sulla base del morsetto. Quindi, le guarnizioni rivestite e i coperchi superiori in PC vengono impilati l'uno sull'altro, seguiti dalla parte superiore del morsetto. Infine, il morsetto viene serrato per comprimere le guarnizioni e rendere il sistema privo di perdite e a tenuta di gas. La Figura 4 illustra le diverse parti necessarie per l'assemblaggio.
   1. Autoclavare i morsetti e i due coperchi del PC (superiore e inferiore) prima del montaggio.
   2. Serrare le viti utilizzate per assemblare le parti superiore e inferiore del morsetto (Figura 4C,D). Aprire le viti prima del processo di sterilizzazione in autoclave e serrarle nuovamente in seguito.
   3. Trasferire il coperchio inferiore del PC rivestito e asciugato (passaggio 2.2.3) (Figura 4 A1) dalla piastra di Petri quadrata alla parte superiore della base del morsetto tenendo le quattro viti negli angoli del coperchio del PC.
      NOTA: Evitare di toccare il coperchio del PC per ridurre il rischio di contaminazione.
   4. Posizionare la guarnizione della camera epiteliale rivolta verso l'alto (cioè con la membrana in alto) sul coperchio del PC utilizzando una pinzetta sterile. Utilizzare le viti per allineare la guarnizione e il coperchio del PC per assicurarsi che le porte di ingresso e uscita negli angoli del coperchio siano allineate con le aperture della guarnizione (Figura 3).
   5. Usando le pinzette sterili, posiziona la guarnizione a sandwich sopra la guarnizione in collagene, con il lato superiore rivolto verso l'alto.
   6. Posizionare il coperchio superiore del PC sopra la guarnizione a sandwich. Per ridurre il rischio di contaminazione, farlo toccando solo i bordi del coperchio (non toccare la parte superiore o inferiore del coperchio). Assicurarsi che le spine sul clamp coperchio allineato con l'ingresso e l'apertura di uscita sul gruppo membrana e che le viti del coperchio del PC inferiore si inseriscano nell'apertura del coperchio del PC superiore.
   7. Per chiudere il dispositivo, posizionare il coperchio del morsetto (la parte superiore del morsetto) sopra il coperchio del PC. Assicurarsi che le aperture del coperchio coincidano con le alette di ingresso e uscita del coperchio superiore del PC. Chiudere i fermi. Tenere il dispositivo chiuso (Figura 5) sotto il cofano per collegarlo alle linee di tubi adescate (passaggio 3.2.6).
2. Adescamento di linee di tubi
   NOTA: Questa sezione descrive come collegare il tubo alle bottiglie di ingresso e di uscita, nonché alla pompa, successivamente adescare il tubo con il fluido per rimuovere eventuali residui di prodotti utilizzati durante la pulizia e la sterilizzazione e assicurarsi che non siano presenti bolle nel tubo.
   1. L'adescamento delle linee di tubi viene eseguito nella cabina di biosicurezza. Inserire aghi di aerazione con filtri nel setto di ogni bottiglia di afflusso e deflusso. Utilizzando una pinzetta pulita e sterile, inserire gli aghi da 120 mm nei flaconi di siero da 250 ml. Inserire gli aghi da 80 mm nei flaconi di siero da 50 ml.
   2. Inserire gli aghi da 40 mm, all'estremità di ciascuna linea di tubi, in un flacone di siero in uscita. Per ogni dispositivo, ci sono due bottiglie di deflusso per le tre linee di tubi. Gli aghi da 40 mm delle linee di tubi epiteliali e neuronali sono collegati allo stesso flacone di deflusso per lo scarto del mezzo. La linea del tubo batterico va al secondo flacone di deflusso.
   3. Inserire le tubazioni della pompa nelle cassette della pompa. Assicurarsi che i rubinetti a tre vie delle linee dei tubi siano tutti aperti.
   4. All'inizio, impostare la pompa peristaltica in modo che diriga il fluido dall'afflusso al flacone di uscita a una velocità di 5 giri/min (vedere la Tabella 4).
      NOTA: Durante l'adescamento della linea di tubi, la velocità può essere aumentata fino a 10 giri/min per accelerare il processo.
   5. Avviare la pompa premendo il pulsante di avvio e assicurarsi che la direzione dell'azione di pompaggio sia in senso orario. Una volta che il fluido cade nelle bottiglie di deflusso, assicurarsi che non vi siano perdite e che non rimangano bolle d'aria nelle linee dei tubi e nei punti di connessione. Rimuovere eventuali bolle rimanenti picchiettando il tubo e i connettori o aumentando la velocità della pompa.
   6. Quando tutte le linee del tubo cadono nelle bombole di deflusso, impostare la portata a 2 giri/min per il collegamento del dispositivo iniziale.
3. Adescamento del dispositivo
   NOTA: Questa sezione descrive come adescare il dispositivo con il terreno di coltura cellulare per garantire che tutte le camere siano riempite e prerivestite con il terreno, in modo che non rimangano bolle nel sistema e le cellule possano aderire facilmente durante l'inoculazione.
   1. L'adescamento del dispositivo viene eseguito nella cabina di biosicurezza in condizioni sterili. Per collegare il dispositivo, inizia collegando la linea neuronale, la camera inferiore del dispositivo.
   2. Per collegare una linea, chiudere le valvole del rubinetto a tre vie (Figura 5C), iniziando prima dal lato di uscita, dove il tubo corto viene scollegato dal connettore Luer femmina e collegato alla porta di uscita dal dispositivo, spingendo il tubo sopra l'ardiglione. Per garantire un collegamento corretto e ridurre la possibilità di perdite e/o contaminazione, assicurarsi che il tubo sia a contatto con il coperchio spingendolo fino in fondo sopra il connettore. Collegare il tubo di afflusso allo stesso modo. Una volta che una linea è completamente collegata al dispositivo (in entrata e in uscita), aprire i rubinetti a tre vie.
   3. Ripetere il passaggio precedente con la linea epiteliale e poi con la linea batterica. Mantenere la pompa a una portata di 2 giri/min. Aumentare la velocità della pompa a 2,5 giri/min, ma non oltre, per evitare perdite dovute all'accumulo di pressione. Lasciare che la pompa adeschi le camere nel dispositivo.
   4. Monitorare sempre i flaconi di siero in uscita. Se le bolle d'aria rimangono bloccate nelle camere, nelle linee o nel connettore, una linea di tubi con una bolla d'aria all'interno non cadrà più nella camera di deflusso. Per eliminare le bolle d'aria, lasciare prima in funzione i dispositivi per alcuni minuti. Se questo non risolve il problema, chiudere una delle altre linee che stanno cadendo per un breve periodo di tempo chiudendo il rubinetto a tre vie del deflusso.
   5. Una volta che tutte le camere del dispositivo sono completamente adescate, tutte le camere sono riempite con terreno di coltura cellulare e non rimangono bolle nel dispositivo, ridurre la velocità della pompa a 0,5 giri/min. Il dispositivo è ora pronto per l'inoculazione cellulare.

4. Preparazione e inoculo delle cellule

NOTA: Questa sezione descrive come preparare i diversi tipi di cellule necessari per inoculare il dispositivo, nonché come inocularle nel dispositivo in modo sterile e senza introdurre bolle d'aria. Inoltre, descrive come eseguire il raffreddamento del terreno per le cellule neuronali e come preparare il terreno per la coltura batterica nel dispositivo.

1. Cellule epiteliali
   1. Staccare le cellule Caco-2 dal matraccio utilizzando l'acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA), risospendere in RPMI 1640 + 10% FBS e contare in un contatore di cellule Neubauer utilizzando il test di esclusione del blu di tripano. Centrifugare la sospensione cellulare Caco-2 (3 min, 300 × g) ed eliminare il surnatante per rimuovere la tripsina-EDTA rimanente. Risospendere le celle Caco-2 in RMPI 1640 + 10% FBS per ottenere una sospensione di 350.000 cellule/mL. Per ogni dispositivo è necessario un volume di 1,5 mL.
   2. Trasferire 1,5 mL della sospensione cellulare Caco-2 in una siringa sterile da 2 mL e rimuovere l'aria o le bolle rimaste nella siringa.
   3. Chiudere le valvole del rubinetto a tre vie del tubo delle camere batteriche e neuronali. Scollegare il tubo delle camere batterica e neuronale dalla pompa rimuovendo le cassette con il rispettivo tubo dal rotore.
   4. Aprire il tappo della valvola di arresto a tre vie del tubo di afflusso che porta alla camera epiteliale e ruotare la valvola di arresto a tre vie per reindirizzare il flusso del fluido dal dispositivo al "connettore aperto" (Figura 5C). Lasciare scorrere il fluido fino a quando non appare una goccia di fluido all'estremità aperta della valvola del rubinetto a tre vie.
   5. Inserire la siringa contenente le cellule epiteliali nel "connettore aperto" utilizzando il metodo di connessione drop-drop per consentire l'inserimento della siringa nel connettore senza l'introduzione di bolle d'aria. Ruotare la valvola del rubinetto a tre vie per arrestare il flusso del fluido dal flacone di afflusso (tramite la pompa) e per consentire il flusso dalla siringa collegata al dispositivo iniziale. Scollegare il canale epiteliale dalla pompa.
   6. Premere lentamente la siringa per inoculare la sospensione cellulare nella camera epiteliale. Assicurarsi che circa una goccia ogni 3 s cada nel flacone di deflusso.
   7. Aggiungere 1,5 mL della sospensione cellulare, quindi chiudere la valvola del rubinetto di arresto a tre vie di deflusso. Scollegare la siringa e chiudere l'estremità aperta del rubinetto a tre vie con il tappo. Tenere la camera chiusa per almeno 2 ore. Nel frattempo, inoculare le cellule neuronali.
2. Cellule neuronali
   1. Staccare le cellule neuronali dal pozzetto risospendendo le cellule nel terreno dai rispettivi pozzetti utilizzando una pipetta. Inoculare ciascun dispositivo con cellule completamente confluenti da un pozzetto (9,6 cm²) di una piastra a 6 pozzetti.
   2. Risospendere il pellet cellulare nel corrispondente volume medio N2B27 (1,5 mL di terreno per dispositivo) + 1 μL di fibronectina/mL di sospensione cellulare. Trasferire 1,5 mL della sospensione cellulare risospesa in una siringa da 2 mL e rimuovere eventuali bolle d'aria rimaste nella siringa. Posizionare la siringa riempita in una provetta conica sterile da 50 mL e trasferirla nell'armadio di biosicurezza contenente il dispositivo HuMiX innescato.
   3. Seguire lo stesso processo di inoculazione descritto in precedenza per l'inoculazione in camera epiteliale, ad eccezione del cambio di linea del tubo. In questo caso, scollegare le linee del tubo batterico ed epiteliale dalla pompa.
   4. Dopo l'inoculazione delle cellule neuronali, chiudere tutti i rubinetti a tre vie delle linee del tubo e scollegare dalla pompa. Posizionare il dispositivo nell'incubatrice a 37 °C e al 5% di CO₂ . Tenere tutti i canali chiusi per 2 ore per consentire alle celle di attaccarsi.
   5. Dopo 2 ore, collegare i canali batterico ed epiteliale alla pompa e aprire i rubinetti di arresto a tre vie di afflusso e deflusso di entrambe le linee. Tenere chiusa la camera neuronale durante i successivi 14 giorni dall'esecuzione iniziale del dispositivo, tranne durante il cambio del fluido.
   6. Durante la corsa di 14 giorni, cambiare il mezzo della camera neuronale ogni 3-4 giorni. Per un aggiornamento medio, preparare 3 ml di terreno N2B27 fresco per dispositivo e trasferire in un flacone sterile di siero da 20 mL. Chiudere il flacone di siero con il terreno utilizzando un setto sterile e una guarnizione a crimpare in alluminio.
   7. Inserire un'aerazione e un ago da 80 mm nel setto del nuovo flacone. Sostituire il vecchio flacone del terreno con quello nuovo nell'incubatrice scollegando il Luer maschio dall'ago del vecchio flacone all'ago del nuovo flacone.
   8. Collegare la cassetta con il tubo della pompa della camera neuronale alla pompa e aprire i rubinetti a tre vie. Lasciare scorrere il fluido a 0,5 giri/min per 2 ore prima di chiudere i rubinetti a tre vie del tubo neuronale e scollegare dalla pompa, fino al successivo scambio del fluido.

5. Coltura batterica e inoculo

NOTA: In questo studio, il giorno 12, una coltura liquida di Limosilactobacillus reuteri ceppo F275 è stata rianimata da uno stock di glicerolo. A seconda delle esigenze o dei disegni di studio, possono essere utilizzate altre specie batteriche.

1. Preparare tre provette con 5 mL di brodo MRS: una provetta di controllo sterile e due per l'inoculazione di L. reuteri. Con un anello di inoculazione, raschiare la parte superiore del brodo di glicerolo e trasferirlo in una provetta. Ripetere l'operazione con un secondo tubo di inoculazione. Incubare le provette a 37 °C, 170 giri/min per una notte.
   NOTA: Non lasciare scongelare il brodo di glicerolo.
2. Preparare un terreno fresco per i dispositivi iniziali mescolando Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 + 10% FBS con brodo MRS al 5%. Preparare 25 mL per dispositivo e trasferire in flaconi di siero da 100 mL in condizioni sterili. Chiudere i flaconi con un setto sterile e una crimpatura in alluminio. Mettere i flaconi nell'incubatrice a 37 °C, 5% CO₂ per una notte.
3. Prima di collegare i flaconi alla linea del tubo batterico, aggiungere un ago di aerazione e un ago da 80 mm a ciascun flacone di terreno RPMI 1640/MRS.
4. Preparare nuove provette, ciascuna con 3 mL di brodo RPMI 1640 + 10% FBS + 5% MRS. Preparare almeno due provette, una di controllo e una provetta per dispositivo. Inoculare 15 μL di coltura notturna di L. reuteri (densità ottica [OD] > 2) in due delle provette appena preparate.
5. Incubare le provette per 1 ora a 37 °C, 170 giri/min, dopodiché si raggiunge un OD di 0,05-0,10, corrispondente a ~1 × 10⁷ unità formanti colonie (CFU)/mL. Trasferire 1,5 mL in una siringa da 2 mL (una per dispositivo). Utilizzare il resto della sospensione batterica per la placcatura CFU e la colorazione viva/morta.
6. Per l'inoculazione batterica del dispositivo, seguire la stessa procedura menzionata al punto 4.1, tranne per il fatto che in questo caso le linee del tubo neuronale ed epiteliale sono chiuse.
7. Dopo l'inoculazione, chiudere anche la linea del tubo batterico, chiudendo le valvole e scollegando dalla pompa per 30 min. Collegare le linee del tubo epiteliale e batterico e riaprire. Lasciare in funzione i dispositivi per altre 24 ore a 37 °C e 0,5 giri/min.

6. Apertura e campionamento di HuMiX

NOTA: La sezione seguente descrive il campionamento di diversi tipi di cellule. Ad esempio, i pellet di cellule neuronali sono utilizzati per l'estrazione dell'RNA e la successiva reazione quantitativa a catena della polimerasi (qPCR), i pellet batterici per l'estrazione del DNA e il sequenziamento del gene rRNA 16S e i surnatanti per i saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e altri saggi (ad esempio, il saggio del lattato).

1. Il giorno 14, il giorno dell'apertura, chiudere tutti i rubinetti a tre vie, scollegare i tubi dalla pompa ed estrarre il dispositivo dell'incubatrice sul banco del laboratorio.
   NOTA: Quando si sposta il dispositivo, assicurarsi di mantenere il dispositivo in posizione orizzontale.
2. Rimuovere le linee di tubi collegate al dispositivo prima di aprire lentamente il clamp e rimuovere il clamp coperchio. Con cautela, rimuovere il coperchio superiore del PC, raccogliere il terreno in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e posizionarlo sul ghiaccio.
3. Rimuovere delicatamente la guarnizione a sandwich, mentre si raccoglie il mezzo dalla camera epiteliale; Fare attenzione a non toccare lo strato cellulare. Posizionare la guarnizione a sandwich in una capsula di Petri quadrata e aggiungere una soluzione sterile di NaCl allo 0,9% in H₂O nella camera batterica fino a coprire completamente la camera (circa 1 mL).
4. Rimuovere lentamente la guarnizione di collagene mentre si raccoglie il terreno dalla camera neuronale e lo si trasferisce in una provetta per microcentrifuga. Posizionare tutti i tubi del supporto sul ghiaccio. Metti la guarnizione di collagene in un piatto quadrato e aggiungi delicatamente alcuni millilitri di PBS 1x allo strato di Caco-2 fino a quando lo strato cellulare non è completamente coperto.
5. Posizionare il coperchio inferiore del PC in una capsula di Petri quadrata e aggiungere delicatamente circa 2 ml di PBS 1x sopra le cellule neuronali, in modo che non si secchino durante il processo di campionamento.
6. Centrifugare la provetta batterica a 5.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Centrifugare le provette epiteliali e neuronali a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante di ciascuna provetta in una nuova provetta per microcentrifuga e posizionarla immediatamente su ghiaccio secco.
7. Cellule epiteliali
   1. Rimuovere delicatamente il PBS dalla guarnizione e raccoglierlo in una provetta conica da 15 mL. Aggiungere 2 mL di tripsina alle cellule e incubare la guarnizione per 5 minuti a 37 °C, 5% CO₂ . Aggiungere 2 mL di RPMI 1640 alla guarnizione dopo l'incubazione, risospendere le cellule e raccoglierle in un'altra provetta conica da 15 mL.
   2. Centrifugare entrambe le provette per 5 minuti a 300 × g. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet dal lavaggio PBS in 300 μL di PBS e il pellet cellulare in 1 mL di PBS.
   3. Trasferire 50 μL di ciascuna provetta in una provetta per microcentrifuga da 0,5 mL per il contatore automatico di cellule e il conteggio delle cellule del test di esclusione del blu di tripano. Trasferire il pellet cellulare risospeso (1 mL) in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 300 × g per 5 min.
   4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 250 μL di tampone di lisi + 1% di beta-mercaptoetanolo e posizionare la provetta su ghiaccio secco.
8. Cellule neuronali
   1. Portare la capsula di Petri quadrata, con il coperchio inferiore in PC trasparente con le cellule neuronali del passaggio precedente (6.5) a un microscopio a contrasto di fase invertito.
      NOTA: Quando si sposta il coperchio del PC con il PBS sopra di esso, sii molto delicato, poiché la rete neuronale si stacca molto facilmente.
   2. Eseguire un ultimo controllo di qualità prima dell'inoculazione osservando la morfologia e la densità cellulare delle cellule neuronali utilizzando la microscopia in campo chiaro. Verificare che le cellule siano migrate dagli sferoidi e che si sia formata una rete neuronale. La rete neuronale dovrebbe essere confluente per circa il 90%. Per maggiori dettagli, fare riferimento a Fattahi et ^al.6.
   3. Al banco, risospendere le cellule in PBS e raccoglierle in una provetta da 1,5 mL. Centrifugare la provetta a 300 × g per 3 min. Scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 250 μL di tampone di lisi + 1% di beta-mercaptoetanolo e porre su ghiaccio secco.
      NOTA: La colorazione a immunofluorescenza (IF) può essere eseguita sulle cellule neuronali sul coperchio del PC. Se la colorazione IF è il test preferito per non distruggere la rete neuronale, le cellule devono essere fissate sul coperchio del PC con il 4% di paraformaldeide (PFA), che impedisce il riutilizzo del coperchio del PC in esperimenti futuri.
9. Cellule batteriche
   1. Risospendere le cellule batteriche attaccate alla membrana in una soluzione di NaCl allo 0,9%. Se le cellule sono saldamente attaccate, utilizzare delicatamente un raschietto per cellule per staccare le cellule batteriche dalla membrana.
      NOTA: L'uso di un raschietto può danneggiare le cellule, aumentando la probabilità di vedere più cellule morte.
   2. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 ml. Aggiungere il pellet rimasto dal terreno precedentemente raccolto nella provetta conica da 15 ml. Centrifugare a 5.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di soluzione di NaCl allo 0,9%.
   3. Dividere questo volume in tre parti: una per il congelamento di un pellet batterico per l'estrazione dell'acido nucleico (650 μL), una per la placcatura CFU (50 μL) su piastre MRS e una per la colorazione viva/morta (300 μL). Per la preparazione del pellet per l'estrazione dell'acido nucleico, trasferire la sospensione cellulare in una provetta per microcentrifuga, centrifugare a 5.000 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Mettere il pellet cellulare sul ghiaccio secco.
   4. Al termine del campionamento, trasferire tutte le provette su ghiaccio secco in un congelatore a -80 °C per la conservazione per le successive analisi a valle.
      NOTA: Il surnatante può essere ulteriormente utilizzato per l'analisi di gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS). Inoltre, durante l'apertura, la membrana rivestita di collagene può essere divisa in diverse parti per diverse analisi: una metà da utilizzare per la colorazione dell'occlusina IF, un'altra parte per l'estrazione dell'RNA per ulteriori analisi dell'espressione genica e un'altra parte per il conteggio delle cellule.

Risultati

In neuroHuMiX, abbiamo co-coltivato insieme tre diversi tipi di cellule: cellule batteriche, epiteliali e neuronali (Figura 1). Per assicurarci che le cellule fossero tutte vitali, abbiamo eseguito diversi saggi sui diversi tipi di cellule. Ad esempio, abbiamo eseguito conteggi CFU su cellule batteriche, saggi di conta cellulare e vitalità cellulare sulle cellule epiteliali, mentre le cellule neuronali sono state valutate tramite analisi microscopiche.

Figura 1: Rappresentazione schematica di neuroHuMiX e della sua configurazione sperimentale . (A) Le tre camere sono tenute tra due coperchi del PC per tenerle chiuse. Ogni camera viene riempita con un terreno specifico per le cellule coltivate all'interno. Le diverse camere sono separate da membrane semipermeabili che consentono la comunicazione cellulare tramite fattori solubili che attraversano le membrane. (B) Rappresentazione del setup neuroHuMiX. Ogni camera è collegata a diverse bottiglie di media. Per la camera batterica, per i primi 12,5 giorni, la camera viene collegata a RPMI + 10% FBS, prima di essere cambiata per le ultime 36 h a RPMI + 10% FBS + 5% MRS. Abbreviazioni: PC = policarbonato; P/L/F = poli L-ornitina/laminina/fibronectina; RPMI = terreno di coltura cellulare del Roswell Park Memorial Institute; MRS = terreno di coltura De Man, Rogosa e Shapre. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per determinare se le cellule erano attaccate in modo appropriato, all'apertura dei dispositivi, abbiamo valutato la formazione di uno strato cellulare sulla membrana rivestita di collagene (Figura 6A). Per assicurarsi che le cellule nel dispositivo fossero vitali, è stato eseguito un conteggio automatico dei contatori di cellule (Figura 6B) e un conteggio delle cellule del test di esclusione del blu di tripano (Figura 6C). I saggi sono stati eseguiti su cellule Caco-2 provenienti da tre diverse configurazioni HuMiX: (i) Caco-2 in coltura con EN, (ii) Caco-2 in coltura con L. reuteri e (iii) il dispositivo che prevede la co-coltura di tutti e tre i tipi cellulari. I test statistici che utilizzano un'ANOVA unidirezionale non hanno prodotto differenze significative tra i tipi di cellule, suggerendo che le cellule Caco-2 sono rimaste vitali in tutte queste configurazioni iniziali del dispositivo e nelle condizioni testate in questo studio. Ciò sottolinea il fatto che la densità batterica raggiunta durante la co-coltura di L. reuteri e dei due tipi di cellule umane non ha effetti citotossici sulle cellule umane.

Figura 6: Valutazione delle cellule Caco-2 sulla membrana rivestita di collagene. (A) Strato di cellule Caco-2 sulla membrana rivestita di collagene dopo l'apertura. La freccia indica la membrana rivestita di collagene, circondata da un cerchio tratteggiato. Le cellule Caco-2 crescevano a forma di spirale sulla membrana. Vitalità cellulare delle cellule Caco-2 dopo 14 giorni in HuMiX. La conta delle cellule è stata ottenuta utilizzando (B) il contatore cellulare automatizzato e (C) la conta delle cellule del test di esclusione del blu di tripano. La conta delle cellule Caco-2 è stata determinata da diverse configurazioni di coltura nel dispositivo iniziale: co-coltura con neuroni enterici (EN) (nero), co-coltura con L. reuteri (arancione) e nel dispositivo (ENs e L. reuteri) (blu). È stata eseguita un'ANOVA unidirezionale, che ha mostrato che non vi è alcuna differenza significativa tra le diverse configurazioni di coltura (ANOVA unidirezionale, p = 0,1234 [ns]; le barre di errore indicano l'errore standard). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per essere in grado di coltivare L. reuteri con cellule di mammifero, abbiamo prima ottimizzato e adattato il terreno di coltura per l'uso nel dispositivo. Abbiamo scoperto che una miscela al 5% di MRS in RPMI 1640 (integrata con il 10% di FBS) era ottimale per la crescita di L. reuteri, pur non essendo citotossica per le cellule di mammifero utilizzate in questi saggi. Successivamente, è stato eseguito un conteggio CFU per valutare la crescita di L. reuteri quando coltivato nel dispositivo per 24 ore. Il conteggio dei CFU è stato valutato per due diverse configurazioni iniziali del dispositivo (Figura 7): L. reuteri co-coltivato con Caco-2 e L. reuteri nel dispositivo. In entrambe le configurazioni, i conteggi delle CFU erano significativamente diversi dall'inoculo HuMiX e dalle cellule raccolte (ANOVA unidirezionale, p = 0,0002), indicando la crescita delle cellule batteriche all'interno del dispositivo iniziale.

Figura 7: Conteggio delle CFU di Limosilactobacillus reuteri dell'inoculo (diluito 1:100.000) e dopo 24 ore in HuMiX. Due diverse configurazioni: cellule Caco-2 in co-coltura con L. reuteri e il dispositivo. Un'ANOVA unidirezionale mostra una differenza significativa (p = 0,0002 [***]) tra l'inoculo e le cellule raccolte, il che significa che i batteri stanno crescendo all'interno di HuMiX. Le barre di errore indicano l'errore standard. Abbreviazioni: CB. HX = batteri Caco-2 HuMiX; nHX = neuroHuMiX. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per valutare se la coltura delle EN all'interno del dispositivo avrebbe alterato il fenotipo delle cellule, la morfologia grossolana delle EN è stata osservata utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito. Durante questa fase, sono state valutate sia la confluenza che la morfologia EN. La creazione di una rete neuronale confluente ha indicato che le cellule si erano attaccate bene al coperchio del PC del dispositivo rivestito. È importante sottolineare che questo evidenzia l'idea che siano cresciuti in co-coltura con Caco-2 e L. reuteri. Il confine tra la rete neuronale confluente e la spirale delineata dalla guarnizione era chiaramente evidente (Figura 8).

Figura 8: Neuroni enterici dopo 14 giorni di coltura nel dispositivo. Sul lato sinistro dell'immagine, i neuroni sono cresciuti fino a formare uno strato confluente sulla spirale. Il bordo, tra lo strato neuronale e lo spazio senza cellule, è il bordo della spirale; ingrandito 10x, barra della scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Coperchi utilizzati nel dispositivo. Le immagini mostrano i coperchi del PC in alto (a sinistra) e in basso (a destra). Ogni lato del coperchio del PC è di 6,4 cm. Abbreviazione: PC = policarbonato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Guarnizione della camera epiteliale sul coperchio inferiore del PC. Vista dall'alto della guarnizione della camera epiteliale posizionata sul coperchio inferiore del PC (a sinistra) e vista dal basso (a destra) che mostra l'allineamento della guarnizione della camera epiteliale con gli ingressi e le uscite del coperchio inferiore del PC. Ogni lato delle guarnizioni, così come il coperchio in PC, misura 6,4 cm. Abbreviazione: PC = policarbonato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Assemblaggio del dispositivo. (A) Diverse parti per l'assemblaggio di HuMiX: (1) coperchio inferiore del PC; (2) guarnizione con membrana microporosa rivestita di collagene, che viene posizionata sopra (1); (3) guarnizione a sandwich con una membrana nanoporosa rivestita di mucina in mezzo e posizionata sopra (2); (4) coperchio superiore del PC posizionato sopra (3). Ogni lato delle guarnizioni e dei coperchi in PC misura 6,4 cm. (B) Tutte le parti di (A) sono posizionate insieme. (C,D) Dispositivo assemblato: vista dall'alto (a sinistra) e laterale (a destra). B viene inserito nel sistema di bloccaggio per chiudere il sistema. (C) Ogni lato del morsetto superiore misura 8 cm. Abbreviazione: PC = policarbonato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Parti necessarie per la linea di tubi e linea di tubi assemblata per una camera. (A) Diverse parti per costruire una linea di tubi: a. linea di tubi della pompa; b. rubinetto a tre vie; c. ago da 40 mm; d. ago da 80 mm; e. ago da 120 mm; f. tubo lungo (20 cm); g. tubo corto (8 cm); h. Luer maschio; i. Luer femmina; J. Adattatore. (B) Linea di tubi assemblata per la camera batterica o epiteliale. Per la camera neuronale, l'ago da 120 mm dovrebbe essere sostituito con un ago da 80 mm. (C) Valvola di arresto a tre vie ruotata per reindirizzare il flusso del fluido dal dispositivo al "connettore aperto" e per chiudere la camera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Giorno	0	2	4	6	8	10
Composizione dei supporti	100% E6	100% E6	75% E6	50% E6	25% E6	100% N2
	+ LDN	+ LDN	25% N2	50% N2	75% N2	+ LDN
	+ SB	+ SB	+ LDN	+ LDN	+ LDN	+ SB
		+ CHIR	+ SB	+ SB	+ SB	+ CHIR
			+ CHIR	+ CHIR	+ CHIR	+ AR
				+ AR	+ AR
Molecola	[concentrazione]
LDN	100 nanometro
SB	10 μM
CHIR	3 μM
Acido retinoico (RA)	1 μM

Tabella 1: Composizione dei supporti.

Media	Componenti (concentrazioni elencate nella tabella dei materiali)	Volume (mL)
Terreni N2 (50 mL)	DMEM-F12	48
	Supplemento N2	0.5
	L-Glutammina	0.5
	Penicillina/Streptomicina	0.5
	NEAA	0.5
Terreni di prova N2B27/ENS (50 mL)	Neurobasale	48
	Supplemento N2	0.5
	L-Glutammina	0.5
	Penicillina/Streptomicina	0.5
	B27-A	0.5

Tabella 2: Ricette dei media.

Temperatura di sterilizzazione (°C)	116
Tempo di sterilizzazione (min)	20
Tempo di asciugatura (min)	10
Impulsi	3
Temperatura finale (°C)	99

Tabella 3: Funzionamento dell'autoclave HuMiX.

Rotazioni al minuto (giri/min)	Portata media (μL/min)
0.5	13
2	79
5	180

Tabella 4: Portate della pompa peristaltica.

Discussione

È ormai accertato che il microbioma intestinale umano influenza la salute e la malattia dell'ospite. Nonostante le conoscenze suggeriscano l'importanza del nostro microbioma, soprattutto nei disturbi neurologici come il morbo di Alzheimer o il morbo di Parkinson ^3,13, rimane in gran parte sconosciuto come il microbioma intestinale interagisca con il sistema nervoso enterico e, successivamente, con il cervello.

Un modello rappresentativo per studiare le interazioni tra il microbioma intestinale e il sistema nervoso non è stato finora disponibile. Gli studi riguardanti l'asse intestino-cervello sono stati tradizionalmente condotti utilizzando modelli murini¹³. I topi e gli esseri umani condividono l'85% delle loro sequenze genomiche¹⁴, ma ci sono differenze significative da considerare quando si confrontano i topi con gli esseri umani. Per quanto riguarda l'intestino, è importante notare che, rispetto agli esseri umani, i topi sono esclusivamente erbivori. Di conseguenza, il loro tratto gastrointestinale differisce per lunghezza e caratteristiche, come lo "svuotamento gastrico"¹⁴. Anche i cervelli murini mostrano importanti differenze, per cui la struttura complessiva tra topi e esseri umani è diversa¹⁵. È importante sottolineare che gli esseri umani hanno tempi di ciclo cellulare più lunghi dei progenitori neurali¹⁵. Di conseguenza, è importante sviluppare modelli rappresentativi che includano cellule di derivazione umana, comprese le cellule intestinali e neuronali⁵. In questo contesto, lo sviluppo di una ricerca più riproducibile attraverso modelli in vitro riduce la necessità di utilizzare modelli animali e migliora la riproducibilità.

neuroHuMiX è una versione avanzata del precedente modello HuMiX⁹. HuMiX è un modello gut-on-a-chip che consente co-colture prossimali e rappresentative di cellule epiteliali e batteriche. La comunicazione cellula-cellula è possibile attraverso la co-coltura prossimale e la diffusione di fattori secreti e metaboliti attraverso membrane semipermeabili. Tuttavia, per espandere l'utilità del dispositivo iniziale per studiare l'ambiente intestinale umano, è necessaria l'introduzione di un ulteriore tipo di cellula. Per affrontare questo problema, neuroHuMiX, sviluppato con l'introduzione di EN derivate da iPSC, consente una co-coltura prossimale di batteri, cellule epiteliali intestinali e EN. Il modello in vitro risultante ci consente di rispondere a domande riguardanti il microbioma intestinale umano in relazione al sistema nervoso umano. La co-coltura di diversi tipi di cellule, in particolare le co-colture di cellule e batteri di mammifero, presenta diverse sfide, tra cui la perdita di vitalità, la scarsa adesione e la perdita complessiva di confluenza¹⁶. Qui, abbiamo dimostrato che all'interno di questo dispositivo, siamo in grado di co-coltivare tre diversi tipi di cellule all'interno dello stesso sistema mantenendo alta la vitalità cellulare.

Un passaggio fondamentale nel protocollo è quello di garantire la confluenza delle cellule neuronali - 80%-90% di confluenza e vitalità cellulare - prima di inoculare nel dispositivo. Poiché non è possibile valutare la crescita cellulare durante la corsa, è della massima importanza assicurarsi che le cellule siano confluenti e crescano bene prima di introdurle nel modello. Sebbene questo possa essere un fattore limitante, la vitalità complessiva e la confluenza osservate all'interno del dispositivo sono generalmente elevate.

Il dispositivo è collegato tramite linee di tubi a una pompa peristaltica. Ogni camera cellulare ha la sua specifica linea di tubi. Il tubo comprende un tubo della pompa che consente l'uso di una pompa peristaltica per la perfusione del fluido, nonché un tubo che collega il tubo della pompa al dispositivo e un tubo che collega il dispositivo alle bottiglie di deflusso/scarico. Le porte di campionamento sono incluse prima e dopo il dispositivo, per consentire l'inoculazione e il campionamento del mezzo in uscita. Ogni camera può essere collegata a un terreno diverso, consentendo le migliori condizioni di coltura per ogni singolo tipo di cellula. Ogni camera può essere aperta o chiusa a seconda delle specifiche esigenze di alimentazione del fluido. Nel dispositivo, la camera neuronale rimane chiusa per la maggior parte dell'esperimento, mentre le camere batteriche ed epiteliali sono sempre aperte, il che significa che ricevono terreno fresco durante l'intera esecuzione sperimentale. Per assicurarsi che il fluido scorra senza interruzioni, è fondamentale che non rimanga aria nei tubi, nei connettori o nel dispositivo. Pertanto, è importante lasciare in funzione i dispositivi per alcuni minuti nella fase di adescamento. Questo spesso risolve il problema. In caso contrario, una delle altre linee che stanno cadendo può essere chiusa per un breve periodo di tempo chiudendo il rubinetto di arresto a tre vie del deflusso. Questo reindirizza il fluido verso la linea con la bolla d'aria, risolvendo così il problema spingendo la bolla verso l'esterno attraverso il tubo.

Per qualsiasi esperimento di coltura cellulare, il terreno è un componente chiave, in cui ogni tipo di cellula ha il suo rispettivo terreno. In una configurazione di co-coltura, il terreno deve essere compatibile non solo per il tipo di cellula che cresce al suo interno, ma anche per gli altri tipi di cellule all'interno della co-coltura. Questo non è diverso per il dispositivo, che rappresenta un'ulteriore sfida in quanto abbiamo tre diversi compartimenti con tre diversi tipi di cellule all'interno: cellule batteriche, epiteliali e neuronali. Abbiamo, tuttavia, dimostrato che modificando il terreno batterico - con l'aggiunta del 5% di MRS a RPMI 1640 con il 10% di FBS - tutti i tipi di cellule, in particolare le cellule batteriche ed epiteliali, possono essere co-coltivati con successo all'interno del sistema. Tuttavia, nel dispositivo, diversi tipi di cellule sono co-coltivati in prossimità e quindi non sono in contatto diretto tra loro. Anche se questo non è completamente rappresentativo del contatto diretto tra le cellule nell'intestino umano, e quindi una limitazione, la condizione di co-coltura prossimale e rappresentativa è un punto di forza per le analisi a valle. Scambio di fattori solubili tra le diverse camere e tipi cellulari; Quindi, le cellule stanno ancora interagendo tra loro. Inoltre, il fatto che i tipi di cellule possano essere raccolti e analizzati separatamente ci consente di studiare l'effetto di un microbioma sano e/o malato su diversi tipi di cellule (comprese le cellule neuronali) e quindi determinare/recuperare letture specifiche per tipo di cellula. Un'altra limitazione è che la morfologia delle cellule non può essere seguita durante l'esecuzione sperimentale, poiché il dispositivo può essere aperto e le cellule controllate solo alla fine di ogni esperimento.

Per quanto ne sappiamo, neuroHuMiX è il primo modello gut-on-a-chip che include EN. Questo è un passo verso il chiarimento della comunicazione tra il microbiota intestinale e il sistema nervoso enterico. Si tratta di un modello che consente di studiare l'interazione tra una specie batterica, uno strato epiteliale e EN. Il suo design ci permette di studiare lo scambio di fattori solubili secreti dai diversi tipi di cellule e il loro effetto l'uno sull'altro. In futuro, sarebbe importante avere non solo EN derivate da iPSC, ma anche cellule epiteliali derivate da iPSC all'interno del dispositivo, per trasformare il dispositivo in un modello personalizzato. È importante sottolineare che questo modello personalizzato potrebbe essere utilizzato per testare pre-, pro- e simbiotici ^10,11 e potenzialmente sviluppare screening personalizzati e approcci terapeutici¹⁷. NeuroHuMiX personalizzato potrebbe infine far luce sulla "materia oscura" del microbioma intestinale umano e sulle sue interazioni con il sistema nervoso lungo l'asse microbioma intestinale-sistema nervoso, aprendo la strada alla valutazione e agli interventi terapeutici.

Possiamo concludere che essere in grado di avere un gut-on-a-chip che includa il sistema neuronale enterico è fondamentale per progredire nello studio e nella comprensione delle interazioni lungo l'asse microbioma intestinale-sistema nervoso. NeuroHuMiX ci permette di studiare gli effetti delle specie batteriche sulle cellule ospiti e ci fornisce una buona base per migliorare ulteriormente il modello in modo ancora più fisiologicamente rappresentativo.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	10712
Aeration cannula (length: 1.10 diameter: 30 mm)	VWR (B.Braun)	BRAU4190050
Agar-agar	Merck Millipore	1.01614.1000
Aluminium Crimp	Glasgerätebau Ochs	102050
Ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4544
B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x)	Gibco	12587-010
Bacterial Cell Membrane, pore size: 1 µm	VWR (Whatman)	515-2084
Caco-2 cells	DSMZ	ACC169
Cell Counter & Analyzer CASY	OMNI Life Sceince
CHIR	Axon Mechem BV	CT99021
Collagen I, Rat Tail	Invitrogen	A1048301
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plates	Corning	3471
Difco Lactobacilli MRS Broth	BD Biosciences	288130
Discofix 3-way stopcock	B. Braun	BRAU40951111
DMEM/F12, no glutamine	Thermofisher Scientific	21331020
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, D-PBS	Sigma Aldrich	14190-169
Essential 6 Medium	Thermofisher Scientific	A1516401
Essential 8 Medium	Thermofisher Scientific	A1517001
Female Luer Lock to Barb Connector	Qosina	11733
FGF2	R&D Systems	233-FB
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
Foetal Bovine Serum, FBS	Thermofisher Scientific	10500-064
GDNF	PeproTech	450-10
Human Cell Membrane, pore size: 50 nm	Sigma Aldrich (GE Healthcare)	WHA111703
HuMiX Gasket Collagen	Auer Precision	216891-003
HuMiX Gasket Sandwich Bottom	Auer Precision	216891-002
HuMiX Gasket Sandwich Top	Auer Precision	216891-001
iPSC	Max Planck Institute for Molecular Biomedicine	K7 line
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
Laminin from Engelbreth-Holmswarm	Sigma Aldrich	L2020
LDN193189	Sigma Aldrich	SML0559
Limosilactobacillus reuteri	ATCC	23272
Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit	Thermofisher Scientific	L7012
Male Luer with Spin Lock to Barb	Qosina	11735
Marprene tubing (0.8 mm x 1.6 mm)	Watson-Marlow	902.0008.J16
Matrigel hESC-qualified matrix	Corning	354277
Mucin, from porcine stomach	Sigma Aldrich	T3924
N2 Supplement (100x)	Gibco	17502048
NEAA	Thermofisher Scientific	11140050
Needle (length: 120 mm; diameter: 0.80 mm)	B.Braun (color code: green)	466 5643
Needle (length: 40 mm; diameter: 0.70 mm)	Henke Sass Wolf (color code: black)	4710007040
Needle (length: 80 mm; diameter: 0.60 mm)	B.Braun (color code: blue)	466 5635
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
PE/Cy7 anti-human CD49d antibody	Biolegend	304314
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781
Peristaltic pump	Watson-Marlow	205CA
Poly-L-ornithine Hydrobromide	Sigma Aldrich	P3655
Polycarbonate lids (HuMiX)	University of Arizona	HuMiX 1.0 / 2.0
Retinoic Acid	Sigma Aldrich	R2625
RLT Buffer (RNeasy Minikit)	Qiagen	74104
RPMI 1640 Medium	Thermofisher Scientific	72400-021
SB431542, ALK inhibitor	Abcam	ab120163
Serum bottles	Glasgerätebau Ochs	102091
Syringe	BD Biosciences	309110
Trypsin-EDTA solution	Sigma Aldrich	T3924
Y-27632 Dihydrochloride	R&D Systems	1254