Fonte: Vy M. Dong e Diane Le, Dipartimento di Chimica, Università della California, Irvine, CA
La sintesi in fase solida di Merrifield è un'invenzione vincitrice del premio Nobel in cui una molecola reagente è legata su un supporto solido e subisce successive reazioni chimiche per formare un composto desiderato. Quando le molecole sono legate a un supporto solido, i reagenti e i sottoprodotti in eccesso possono essere rimossi lavando via le impurità, mentre il composto bersaglio rimane legato alla resina. In particolare, mostreremo un esempio di sintesi peptidica in fase solida (SPPS) per dimostrare questo concetto.
Procedura
1. Caricamento della resina
In un recipiente di sintesi peptidica da 100 ml, aggiungere resina di cloruro di 2-clorotrityl (CTC) (1,1 mmol / g, 0,360 g, 0,400 mmol). Aggiungere 20 mL DMF e lasciarli gonfiare per 30 minuti sotto N2.
Scolare le perle sotto vuoto e aggiungere 10 mL di DMF.
Aggiungere 500 mg di Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) e 2,5 mL i-Pr2EtN e mescolare sotto N2 per 15 minuti.
Scaricare il solvente sotto vuoto e ripetere il caricame
Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here
Risultati
Risultati rappresentativi per la sintesi di peptidi in fase solida per la procedura 3.
Fase della procedura
Colore della soluzione
3.1
Controllo - Chiaro, giallo chiaro Reazione – Chiaro, giallo chiaro
3.2
Controllo - Chiaro, giallo chiaro Reazione – Blu scuro
3.3
Soluzione blu scuro, perle blu – completa dep...
Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here
Applicazione e Riepilogo
In questo esperimento, abbiamo dimostrato un esempio di sintesi in fase solida tramite SPPS attraverso la sintesi di un dipeptide.
La sintesi in fase solida è ampiamente utilizzata nella chimica combinatoria per costruire librerie di composti per lo screening rapido. È stato comunemente usato per sintetizzare peptidi, oligosaccaridi e acidi nucleici. Inoltre, questo concetto è stato implementato nella sintesi chimica. Poiché è eterogeneo, questi reagenti supportati da solidi possono spess...
Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here
In un recipiente di sintesi peptidica da 100 ml, aggiungere resina di cloruro di 2-clorotrityl (CTC) (1,1 mmol / g, 0,360 g, 0,400 mmol). Aggiungere 20 mL DMF e lasciarli gonfiare per 30 minuti sotto N2.
Scolare le perle sotto vuoto e aggiungere 10 mL di DMF.
Aggiungere 500 mg di Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) e 2,5 mL i-Pr2EtN e mescolare sotto N2 per 15 minuti.
Scaricare il solvente sotto vuoto e ripetere il caricamento con Fmoc-Ala-OH per 15 min.
Scaricare il solvente sotto vuoto e lavare le perle con 10 ml DMFunder N2e scaricare sotto vuoto 3x.
2. Deprotezione del Gruppo Fmoc
Aggiungere 10 mL 20% 4-metilpiperidina in DMF e mescolare le perle sotto N2 per 15 min.
Scaricare il solvente sotto vuoto e ripetere la deprotezione.
Lavare le perle con 10 mL DMF sotto N2 e scolare sotto vuoto 3x.
3. Esecuzione del Kaiser Test
Eseguire il test Kaiser aggiungendo 1-2 gocce di soluzione A (0,5 mL 0,01 M KCN, 24,5 mL piridina), soluzione B (1 g ninidrina, 20 mL n-butanolo) e soluzione C (20 g fenolo, 10 ml n-butanolo)ciascuna in due provette. Una provetta sarà il controllo mentre l'altra monitorerà la reazione.
Aggiungere alcune pere di resina dal recipiente di reazione alla provetta di reazione e riscaldare le due provette a 110 °C.
Se la deprotezione è completa, il contenuto della provetta diventerà di un colore blu scuro/viola. Se la deprotezione è incompleta o non riuscita, la soluzione rimarrà gialla. Confrontare la provetta di reazione con la provetta di controllo.
4. Accoppiamento dei prossimi elementi costitutivi
Scaricare il solvente sotto vuoto.
Lavare le perle con 10 ml di N-metil-2-pirrolidone sotto N2 e scaricare il solvente sotto vuoto.
Per iniziare l'accoppiamento successivo, aggiungere 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), 610 mg HBTU (1,6 mmol) e 2,5 mLi-Pr2EtN e lasciare bollire la resina sotto N2 per 30 minuti.
Scaricare il solvente sotto vuoto.
Lavare le perle con 10 mL DMF sotto N2 e scolare sotto vuoto 3x.
Eseguire il test Kaiser (vedere i passaggi 3.1-3.3) per cercare il completamento dell'accoppiamento. Le pere e la soluzione nella provetta devono essere gialle.
5. Scindere il peptide dalla resina
Scindere il gruppo Fmoc rimanente utilizzando i passaggi 2.1-2.3.
Dopo che il solvente è stato drenato sotto vuoto, aggiungere 40 mL di soluzione di scissione (95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% TIPS) alla resina e bolle sotto N2 per 3 ore.
Posizionare un nuovo pallone ricevente sul sintetizzatore peptidico e scolare la soluzione di FIA contenente il peptide desiderato sotto vuoto nel nuovo matraccio.
6. Precipitazione e I solazione del peptide
Separare la soluzione di TFA in 4 flaconcini conici e aggiungere 25 mL di etere freddo (-20 °C) a ciascun flaconcino per precipitare il peptide.
Centrifugare i flaconcini (3.000 giri/min, 0-4 °C) per 20 min. Decantare il TFA rimanente e la soluzione di etere dalle fiale coniche e concentrare il precipitato peptidico per consentire il dipeptide desiderato come solido bianco.
